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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 学习PCR基础实验操作工具流程相关知识
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猪头锦想长高

金虫 (小有名气)

[求助] 学习PCR基础实验操作工具流程相关知识 已有1人参与

想学习PCR的相关基础知识，有没有好心人教一下或者发个链接。。。
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1楼 2018-12-28 10:02:11
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hmouse

新虫 (正式写手)
买本书或者到图书馆借一本相关的就行了，最好自己动手做一下实验。

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2楼2018-12-28 14:46:33
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guimu

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
猪头锦想长高(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2019-01-03 13:51:52
一．PCR
1.EP管（1.5mL），高压锅灭菌，烘干过夜；
2.离心机预约和EP管名称标记；
3.小鼠尾裂解工作液的配制：
3.1原裂解液﹕蛋白酶K=150/200﹕1；
3.2裂解液总体V=样品数n×500μL/tube；
3.3蛋白酶K存放位置：-20℃冰箱，冰上溶化；

4.剪鼠脚标，剪鼠尾（0.5~1 cm），裂解，酒精洗剪刀；
5.摇床过夜（56℃，200 rpm）（临时不用-20℃保存）；
6.次日取鼠尾（or -20℃取出鼠尾裂解物，室温解冻），
离心（12000g，5min）；同时，PCR（凸）孔板记录本排序；

7.配PCR体系
PCR体系终配比
（1）        （2）        （3）        （4）
DNA模板        Primer(1P)        DEPC水        BSA        GT Buffer        Taq酶        dNTP
1.5        3        7.8        0.2        1.5        1        1.5
注：热手动：预变性→加dNTP→启动。

7.1 DNA模板：超纯水(100μL) + 鼠尾裂解物“上清”(5μL)，瞬离；
7.2 Primer(1P)混合引物：
Primer(1P)
10对引物(100μL)         10对引物(10P)混合稀释到1P，需各加10μL引物(10P)，组成总体积(100μL)
8 对应物(100μL)        8对引物(10P)混合稀释到1P，需各加10μL引物(10P)+DEPC水(20μL)，组成总体积(100μL)

7.3 Part-Mix配置：
Part-Mix (13.5μL)
DEPC水        GT Buffer        Primer(1P)        BSA        Taq酶
7.8        1.5        3.0        0.2        1
总体积V1        V1 = n(孔数)×13.5μL

7.4 预变性：PCR仪，95℃, 15min（Part-PCR混合液，dNTP未添加）；
PCR体系(16.5μL)
Part-Mix        DNA模板        dNTP
13.5        1.5        1.5
注：1）Part-Mix、DNA模板和dNTP按孔添加；2）dNTP热启动后添加。
8. 石蜡油密封PCR体系，瞬离；
9. PCR程序设定；
分组        预变性        循环（35cycles）        终止        退火
                变性        退火        延伸               
第1组        95℃, 15min        94℃，30s        50℃, 90s        72℃，60s        72℃, 10min        50℃, 10min
第2组        95℃, 15min        94℃，30s        45℃, 90s        72℃，60s        72℃, 10min        50℃, 10min
第3组        95℃, 15min        94℃，30s        59℃, 90s        72℃，60s        72℃, 10min        50℃, 10min

10. PCR产物4℃保存；
11. 琼脂糖凝胶电泳检测：
11.1 琼脂糖凝胶(2%)配制：琼脂糖(2g) + ET (1mL)，加热（高中火，3min）；冷却，+Dyred(5μL)，除泡，插梳子，倒-凝-切胶，4℃保存；
11.2 buffer+sample混合，点样，电泳(180V，20min)，显影。
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阿拉山脉风口的猪。。。
3楼2018-12-28 20:16:43
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