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学习PCR基础实验操作工具流程相关知识 已有1人参与
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想学习PCR的相关基础知识，有没有好心人教一下或者发个链接。。。 |
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2楼2018-12-28 14:46:33
guimu
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【答案】应助回帖
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猪头锦想长高(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2019-01-03 13:51:52
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一．PCR 1.EP管（1.5mL），高压锅灭菌，烘干过夜； 2.离心机预约和EP管名称标记； 3.小鼠尾裂解工作液的配制： 3.1原裂解液﹕蛋白酶K=150/200﹕1； 3.2裂解液总体V=样品数n×500μL/tube； 3.3蛋白酶K存放位置：-20℃冰箱，冰上溶化； 4.剪鼠脚标，剪鼠尾（0.5~1 cm），裂解，酒精洗剪刀； 5.摇床过夜（56℃，200 rpm）（临时不用-20℃保存）； 6.次日取鼠尾（or -20℃取出鼠尾裂解物，室温解冻）， 离心（12000g，5min）；同时，PCR（凸）孔板记录本排序； 7.配PCR体系 PCR体系终配比 （1） （2） （3） （4） DNA模板 Primer(1P) DEPC水 BSA GT Buffer Taq酶 dNTP 1.5 3 7.8 0.2 1.5 1 1.5 注：热手动：预变性→加dNTP→启动。 7.1 DNA模板：超纯水(100μL) + 鼠尾裂解物“上清”(5μL)，瞬离； 7.2 Primer(1P)混合引物： Primer(1P) 10对引物(100μL) 10对引物(10P)混合稀释到1P，需各加10μL引物(10P)，组成总体积(100μL) 8 对应物(100μL) 8对引物(10P)混合稀释到1P，需各加10μL引物(10P)+DEPC水(20μL)，组成总体积(100μL) 7.3 Part-Mix配置： Part-Mix (13.5μL) DEPC水 GT Buffer Primer(1P) BSA Taq酶 7.8 1.5 3.0 0.2 1 总体积V1 V1 = n(孔数)×13.5μL 7.4 预变性：PCR仪，95℃, 15min（Part-PCR混合液，dNTP未添加）； PCR体系(16.5μL) Part-Mix DNA模板 dNTP 13.5 1.5 1.5 注：1）Part-Mix、DNA模板和dNTP按孔添加；2）dNTP热启动后添加。 8. 石蜡油密封PCR体系，瞬离； 9. PCR程序设定； 分组 预变性 循环（35cycles） 终止 退火 变性 退火 延伸 第1组 95℃, 15min 94℃，30s 50℃, 90s 72℃，60s 72℃, 10min 50℃, 10min 第2组 95℃, 15min 94℃，30s 45℃, 90s 72℃，60s 72℃, 10min 50℃, 10min 第3组 95℃, 15min 94℃，30s 59℃, 90s 72℃，60s 72℃, 10min 50℃, 10min 10. PCR产物4℃保存； 11. 琼脂糖凝胶电泳检测： 11.1 琼脂糖凝胶(2%)配制：琼脂糖(2g) + ET (1mL)，加热（高中火，3min）；冷却，+Dyred(5μL)，除泡，插梳子，倒-凝-切胶，4℃保存； 11.2 buffer+sample混合，点样，电泳(180V，20min)，显影。 |
3楼2018-12-28 20:16:43