应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞科学 » 构建载体一直不成功
51/1返回列表
查看: 4538  |  回复: 2
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

兮西熙

新虫 (初入文坛)

[求助] 构建载体一直不成功 已有1人参与

想把目的基因a连在环状载体上，一直构不成功
基因大小2.7kb
说明一下，pcr产物验证没问题，酶切位点选择也核对过没有问题，37度双酶切过夜，胶回收。酶连体系，基因与载体1:5-10都试过，4度过夜连和常温下1-4小时都试过，感受态公司制备，
转化后涂LA平板，长出的单克隆有50个左右.菌落pcr鉴定，通用引物上游加目的基因下游，只有3个有条带，送测序，测序结果不对
还有一种情况是通用引物上游加目的基因下游，无条带，用目的基因的上下游进行菌p验证，用目的基因片段作正对照，有10个左右有条带，提质粒送测序，结果还是不对
已经构了很长时间了，一直不成功，相当迷茫
，希望能有人能指点一下

发自小木虫IOS客户端
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2018-12-06 16:46:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

兮西熙

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by GRUBBY_WU at 2018-12-06 22:15:15
1.目的片段/PCR产物送测序，用正反引物测。如果条带不带一，切目的条带送测；量不够，切胶后以此为模板再PCR，产物纯化后送测序。
2.载体送测序，尤其是多克隆位点的位置，不同测通。
3.目的条带与载体确认没毛病 ...

不好意思哈，今天才看到。谢谢你的提议呀，我下次会按你说的方法改进一下

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
3楼2018-12-08 23:41:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 3 个回答

GRUBBY_WU

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.目的片段/PCR产物送测序，用正反引物测。如果条带不带一，切目的条带送测；量不够，切胶后以此为模板再PCR，产物纯化后送测序。
2.载体送测序，尤其是多克隆位点的位置，不同测通。
3.目的条带与载体确认没毛病后，检查酶切位点，尽量使用有共用buff与酶切条件的常见酶进行双酶切，甚至可以考虑先加一个酶进行酶切，个把小时后再加入第二种酶进行酶切，效率更高。
4.考虑下用的酶有没有问题。
5.使用别的克隆方法，载体片段不大的话，考虑下gibson组装。
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

兮西熙
2019更好更棒!
2楼2018-12-06 22:15:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 3 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +4 Ldrop2023 2026-08-13 4/200 2026-08-14 14:50 by Tide man
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +6 majunge000 2026-08-11 8/400 2026-08-14 14:44 by 医学老男孩
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +23 Lanmanbaby 2026-08-09 37/1850 2026-08-14 13:40 by Equinoxhua
[论文投稿] 职称评审，求友友推荐见刊最快的期刊 +5 工厂打螺丝 2026-08-08 5/250 2026-08-14 11:03 by 玖戈弋
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的，真有人买论文么？感觉没必要啊 +10 Tide man 2026-08-10 11/550 2026-08-14 10:30 by 沁言学术
[基金申请] filecode +15 documentary 2026-08-10 17/850 2026-08-14 10:08 by kissu88
[基金申请] FileCode能看出啥？ +10 要乐观耀哥 2026-08-10 32/1600 2026-08-14 09:37 by 要乐观耀哥
[基金申请] 关于Filecode分析方法 +9 majunge000 2026-08-10 12/600 2026-08-13 23:20 by iwuli
[文学芳草园] 阿姨 +4 汪汪锅 2026-08-09 4/200 2026-08-13 19:43 by arzu_hma
[硕博家园] 一作与独作在应聘高校教师时区别大吗 +3 mbygzh 2026-08-08 4/200 2026-08-13 19:31 by 龙-樱
[基金申请] 静等基金结果 +8 gjjjzhong 2026-08-10 21/1050 2026-08-13 17:56 by 且听虎啸
[基金申请] 重要来源：本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] 综述论文作为代表作会不会影响评审专家的印象分？ +11 yufeiwaner 2026-08-09 13/650 2026-08-12 08:17 by yufeiwaner
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +3 yuleib84 2026-08-11 3/150 2026-08-11 21:53 by jnhyjjm
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:25 by Tide man
[基金申请] 什么时候出结果，有咨询渠道？？？ +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +7 瞬息宇宙 2026-08-10 8/400 2026-08-10 12:42 by Vivilian
[基金申请] 国基金的申报应该改成非等额制，评价高的钱多评价低的钱少，但是增加资助率 +7 a089 2026-08-07 7/350 2026-08-08 18:05 by gltch
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭