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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞科学 » 构建载体一直不成功
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兮西熙

新虫 (初入文坛)

[求助] 构建载体一直不成功 已有1人参与

想把目的基因a连在环状载体上，一直构不成功
基因大小2.7kb
说明一下，pcr产物验证没问题，酶切位点选择也核对过没有问题，37度双酶切过夜，胶回收。酶连体系，基因与载体1:5-10都试过，4度过夜连和常温下1-4小时都试过，感受态公司制备，
转化后涂LA平板，长出的单克隆有50个左右.菌落pcr鉴定，通用引物上游加目的基因下游，只有3个有条带，送测序，测序结果不对
还有一种情况是通用引物上游加目的基因下游，无条带，用目的基因的上下游进行菌p验证，用目的基因片段作正对照，有10个左右有条带，提质粒送测序，结果还是不对
已经构了很长时间了，一直不成功，相当迷茫
，希望能有人能指点一下

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1楼 2018-12-06 16:46:38
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GRUBBY_WU

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.目的片段/PCR产物送测序，用正反引物测。如果条带不带一，切目的条带送测；量不够，切胶后以此为模板再PCR，产物纯化后送测序。
2.载体送测序，尤其是多克隆位点的位置，不同测通。
3.目的条带与载体确认没毛病后，检查酶切位点，尽量使用有共用buff与酶切条件的常见酶进行双酶切，甚至可以考虑先加一个酶进行酶切，个把小时后再加入第二种酶进行酶切，效率更高。
4.考虑下用的酶有没有问题。
5.使用别的克隆方法，载体片段不大的话，考虑下gibson组装。
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兮西熙
2019更好更棒!
2楼2018-12-06 22:15:15
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兮西熙

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by GRUBBY_WU at 2018-12-06 22:15:15
1.目的片段/PCR产物送测序，用正反引物测。如果条带不带一，切目的条带送测；量不够，切胶后以此为模板再PCR，产物纯化后送测序。
2.载体送测序，尤其是多克隆位点的位置，不同测通。
3.目的条带与载体确认没毛病 ...

不好意思哈，今天才看到。谢谢你的提议呀，我下次会按你说的方法改进一下

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3楼2018-12-08 23:41:53
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