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lixiaoyu7

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10楼: Originally posted by snoopytbw at 2018-11-28 11:53:44
就是简单的工程质粒,把你要的靶序列PCR出来,测序,前后接头,转质粒,直接转化就结束了。工程质粒转的是J53,转KP有点难,就成功了一次,而且传代后就丢失了,KP需要用穿梭质粒做转基因...

你好,你说的分段分析是指我做出质粒电泳,或者pfge后酶切然后把我要的质粒胶回收,再提出来,再进行电转吗?还想请教一下如果是低拷贝的大质粒,并且有很多个质粒,是不是就很难接合过去,我用电转也进不去。

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11楼2018-11-29 16:21:39
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lixiaoyu7

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2楼: Originally posted by biosci at 2018-11-27 07:44:51
直接电转化,别整三亲结合了,不靠谱

我电转了,也进不去,不知道怎么办了已经

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12楼2018-11-29 16:22:58
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snoopytbw

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11楼: Originally posted by lixiaoyu7 at 2018-11-29 16:21:39
你好,你说的分段分析是指我做出质粒电泳,或者pfge后酶切然后把我要的质粒胶回收,再提出来,再进行电转吗?还想请教一下如果是低拷贝的大质粒,并且有很多个质粒,是不是就很难接合过去,我用电转也进不去。
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天然有点难,一般条件比较苛刻,要试的。我意思是酶切后回收一段段的重组后表达,看看哪一段有耐药活性
你说的应该是S1-PFGE吧,那个是做质粒图谱,分质粒类型大小的,不一样。
其实最简单就是质粒分型后直接去测序,根本不用烦
13楼2018-11-29 16:40:39
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snoopytbw

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11楼: Originally posted by lixiaoyu7 at 2018-11-29 16:21:39
你好,你说的分段分析是指我做出质粒电泳,或者pfge后酶切然后把我要的质粒胶回收,再提出来,再进行电转吗?还想请教一下如果是低拷贝的大质粒,并且有很多个质粒,是不是就很难接合过去,我用电转也进不去。
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接合转移肯定只能是一种质粒啊,质粒不相容sir,如果你的受体菌是EC600,有些KP的质粒是不合适的,根本转不进去,干嘛非要转天然呢,你这样吧,S1-PFGE后,脉冲场电泳,一般用H9812做marker,看看条带几条,反正我做的几个都是只有1条,嘿嘿。。运气好吧,有的时候会有4~6条说不定呢,尤其ST11这种基因型,特别多。然后你每一个条带代表一种质粒,一个个胶回收,然后再去接合,说不定就成功了,成功的话,告诉我下,我下回也试试。。哈哈
14楼2018-11-29 16:45:37
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lixiaoyu7

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14楼: Originally posted by snoopytbw at 2018-11-29 16:45:37
接合转移肯定只能是一种质粒啊,质粒不相容sir,如果你的受体菌是EC600,有些KP的质粒是不合适的,根本转不进去,干嘛非要转天然呢,你这样吧,S1-PFGE后,脉冲场电泳,一般用H9812做marker,看看条带几条,反正我 ...

好的谢谢谢谢,我的菌就是st11

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15楼2018-11-30 12:23:00
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15楼: Originally posted by lixiaoyu7 at 2018-11-30 12:23:00
好的谢谢谢谢,我的菌就是st11
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你可以试试穿梭质粒,找如下几种,pKOBEG-Apra、pJTAG-Hyg、pFLP2-Apra,都是肺炎克雷伯HS11286的穿梭质粒,可以进行基因重组,不过质粒很难找到,我问了好多老外了,没一个肯送的。唉
16楼2018-11-30 13:35:12
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lixiaoyu7

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14楼: Originally posted by snoopytbw at 2018-11-29 16:45:37
接合转移肯定只能是一种质粒啊,质粒不相容sir,如果你的受体菌是EC600,有些KP的质粒是不合适的,根本转不进去,干嘛非要转天然呢,你这样吧,S1-PFGE后,脉冲场电泳,一般用H9812做marker,看看条带几条,反正我 ...

大神,我问了一个做过这个的师兄,他说我可以试试用肺克做感受态电转,然后我刚才搜索好像看到大神你之前回复别人,做肺克的感受态可行吗对于我这种天然质粒来说,还有做肺克的感受态一般用什么菌呢,ATCC吗?谢谢大神

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17楼2018-12-06 16:42:45
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17楼: Originally posted by lixiaoyu7 at 2018-12-06 16:42:45
大神,我问了一个做过这个的师兄,他说我可以试试用肺克做感受态电转,然后我刚才搜索好像看到大神你之前回复别人,做肺克的感受态可行吗对于我这种天然质粒来说,还有做肺克的感受态一般用什么菌呢,ATCC吗?谢谢 ...

肺克感受态有点难,不过可以做的,我是看到文献有人报道过,我自己没做出来,有点难。做出来粘粘的,都接不了平板,放弃了。我觉得实在不行就把靶基因扩全长,一段段去验证功能吧。或者扩几个基因一起做也可以。天然质粒的接合转移有点难,用电转的话,摸索条件就要做很久,关键每一株菌的敏感性都不一样,很头疼的。你要么一直用一株菌做感受态。试试吧,成功后教教我,嘿嘿。
18楼2018-12-07 11:32:15
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17楼: Originally posted by lixiaoyu7 at 2018-12-06 16:42:45
大神,我问了一个做过这个的师兄,他说我可以试试用肺克做感受态电转,然后我刚才搜索好像看到大神你之前回复别人,做肺克的感受态可行吗对于我这种天然质粒来说,还有做肺克的感受态一般用什么菌呢,ATCC吗?谢谢 ...

我就用实验室现成的药敏标准菌株肺克做了一次,感受态是成功了,不过转进去重组质粒后,一直不表达,就没接着做。你可以用别的标准菌株试试,临床株还是别做了,太难
19楼2018-12-07 11:44:59
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ptlyxiao

新虫 (正式写手)


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您好!我想请教一下你是什么做感受态细胞?

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20楼2019-04-18 16:20:08
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