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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 求助各位做过质粒接合实验的师兄师姐
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lixiaoyu7

新虫 (初入文坛)
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10楼: Originally posted by snoopytbw at 2018-11-28 11:53:44
就是简单的工程质粒，把你要的靶序列PCR出来，测序，前后接头，转质粒，直接转化就结束了。工程质粒转的是J53，转KP有点难，就成功了一次，而且传代后就丢失了，KP需要用穿梭质粒做转基因...

你好，你说的分段分析是指我做出质粒电泳，或者pfge后酶切然后把我要的质粒胶回收，再提出来，再进行电转吗？还想请教一下如果是低拷贝的大质粒，并且有很多个质粒，是不是就很难接合过去，我用电转也进不去。

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11楼2018-11-29 16:21:39
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lixiaoyu7

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2楼: Originally posted by biosci at 2018-11-27 07:44:51
直接电转化，别整三亲结合了，不靠谱

我电转了，也进不去，不知道怎么办了已经

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12楼2018-11-29 16:22:58
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snoopytbw

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11楼: Originally posted by lixiaoyu7 at 2018-11-29 16:21:39
你好，你说的分段分析是指我做出质粒电泳，或者pfge后酶切然后把我要的质粒胶回收，再提出来，再进行电转吗？还想请教一下如果是低拷贝的大质粒，并且有很多个质粒，是不是就很难接合过去，我用电转也进不去。
...

天然有点难，一般条件比较苛刻，要试的。我意思是酶切后回收一段段的重组后表达，看看哪一段有耐药活性
你说的应该是S1-PFGE吧，那个是做质粒图谱，分质粒类型大小的，不一样。
其实最简单就是质粒分型后直接去测序，根本不用烦
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13楼2018-11-29 16:40:39
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snoopytbw

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11楼: Originally posted by lixiaoyu7 at 2018-11-29 16:21:39
你好，你说的分段分析是指我做出质粒电泳，或者pfge后酶切然后把我要的质粒胶回收，再提出来，再进行电转吗？还想请教一下如果是低拷贝的大质粒，并且有很多个质粒，是不是就很难接合过去，我用电转也进不去。
...

接合转移肯定只能是一种质粒啊，质粒不相容sir，如果你的受体菌是EC600，有些KP的质粒是不合适的，根本转不进去，干嘛非要转天然呢，你这样吧，S1-PFGE后，脉冲场电泳，一般用H9812做marker，看看条带几条，反正我做的几个都是只有1条，嘿嘿。。运气好吧，有的时候会有4～6条说不定呢，尤其ST11这种基因型，特别多。然后你每一个条带代表一种质粒，一个个胶回收，然后再去接合，说不定就成功了，成功的话，告诉我下，我下回也试试。。哈哈
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14楼2018-11-29 16:45:37
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lixiaoyu7

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14楼: Originally posted by snoopytbw at 2018-11-29 16:45:37
接合转移肯定只能是一种质粒啊，质粒不相容sir，如果你的受体菌是EC600，有些KP的质粒是不合适的，根本转不进去，干嘛非要转天然呢，你这样吧，S1-PFGE后，脉冲场电泳，一般用H9812做marker，看看条带几条，反正我 ...

好的谢谢谢谢，我的菌就是st11

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15楼2018-11-30 12:23:00
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15楼: Originally posted by lixiaoyu7 at 2018-11-30 12:23:00
好的谢谢谢谢，我的菌就是st11
...

你可以试试穿梭质粒，找如下几种，pKOBEG-Apra、pJTAG-Hyg、pFLP2-Apra，都是肺炎克雷伯HS11286的穿梭质粒，可以进行基因重组，不过质粒很难找到，我问了好多老外了，没一个肯送的。唉
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16楼2018-11-30 13:35:12
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lixiaoyu7

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14楼: Originally posted by snoopytbw at 2018-11-29 16:45:37
接合转移肯定只能是一种质粒啊，质粒不相容sir，如果你的受体菌是EC600，有些KP的质粒是不合适的，根本转不进去，干嘛非要转天然呢，你这样吧，S1-PFGE后，脉冲场电泳，一般用H9812做marker，看看条带几条，反正我 ...

大神，我问了一个做过这个的师兄，他说我可以试试用肺克做感受态电转，然后我刚才搜索好像看到大神你之前回复别人，做肺克的感受态可行吗对于我这种天然质粒来说，还有做肺克的感受态一般用什么菌呢，ATCC吗？谢谢大神

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17楼2018-12-06 16:42:45
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snoopytbw

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17楼: Originally posted by lixiaoyu7 at 2018-12-06 16:42:45
大神，我问了一个做过这个的师兄，他说我可以试试用肺克做感受态电转，然后我刚才搜索好像看到大神你之前回复别人，做肺克的感受态可行吗对于我这种天然质粒来说，还有做肺克的感受态一般用什么菌呢，ATCC吗？谢谢 ...

肺克感受态有点难，不过可以做的，我是看到文献有人报道过，我自己没做出来，有点难。做出来粘粘的，都接不了平板，放弃了。我觉得实在不行就把靶基因扩全长，一段段去验证功能吧。或者扩几个基因一起做也可以。天然质粒的接合转移有点难，用电转的话，摸索条件就要做很久，关键每一株菌的敏感性都不一样，很头疼的。你要么一直用一株菌做感受态。试试吧，成功后教教我，嘿嘿。
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18楼2018-12-07 11:32:15
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snoopytbw

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17楼: Originally posted by lixiaoyu7 at 2018-12-06 16:42:45
大神，我问了一个做过这个的师兄，他说我可以试试用肺克做感受态电转，然后我刚才搜索好像看到大神你之前回复别人，做肺克的感受态可行吗对于我这种天然质粒来说，还有做肺克的感受态一般用什么菌呢，ATCC吗？谢谢 ...

我就用实验室现成的药敏标准菌株肺克做了一次，感受态是成功了，不过转进去重组质粒后，一直不表达，就没接着做。你可以用别的标准菌株试试，临床株还是别做了，太难
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19楼2018-12-07 11:44:59
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ptlyxiao

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您好！我想请教一下你是什么做感受态细胞？

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20楼2019-04-18 16:20:08
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