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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 求助各位做过质粒接合实验的师兄师姐
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lixiaoyu7

新虫 (初入文坛)

[交流] 求助各位做过质粒接合实验的师兄师姐已有4人参与

我做的是肺炎克雷伯菌转移到ec600我的肺克都带有kpc耐药基因，质粒的话最少都有两个质粒并且大小都在90kb，都是低拷贝质粒，已经做了几个月也没有筛到结合子，我用的是利福平300和亚胺2的量，单菌落增菌4h，然后调0.5麦氏，取供受1比2比例混合静止结合4h，取100ul涂板，对照板没有菌，双抗平板长出来的菌落再一次画到双抗平板上就没有了，这是什么原因呢，是我没结合成功，还是质粒结合不稳定，不能继续传代呢？请做过的师兄师姐帮忙看看，之前也做过一次电转，用的是dh5a制备感受态，质粒是用天跟试剂盒提取的，质粒电泳条带非常多，可能是本来细菌就有几个质粒然后质粒电泳又跑出了三种形态的原因，但是电转没有一株成功的，现在很迷茫，卡在这里好久了，后面实验也做不下去真的很无奈。

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1楼2018-11-27 01:15:47
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snoopytbw

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肺炎克雷伯要用穿梭质粒做的，普通不行。专用的穿梭质粒要问老外要，有点烦，我也在问。老外不回邮件也是没办法
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3楼2018-11-27 08:54:09
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snoopytbw

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你受体菌是啥
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4楼2018-11-27 08:57:35
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snoopytbw

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小冀-: 金币+3, 鼓励回帖，有帮助 2018-11-28 12:32:10
哦，看到了EC600，你试试J53吧，反正J53我成功了，另外，天然质粒不太好接合的，我用的还是工程。天然接合太难了。。。。有没有文献转过的呢，我没查到。。。
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5楼2018-11-27 09:00:02
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snoopytbw

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6楼: Originally posted by lixiaoyu7 at 2018-11-27 11:18:07
之前看到有文献转过的，但是自己就不成功，问过之前的师兄他们建议用ec600说比较简单，然后师兄说j53和电转对于肺克转大肠都比较难，你是自己做出来的工程菌转到野生株吗？我实验室有人做这个，他们用的电转，可以 ...

工程质粒都比较简单，但是你这个天然质粒，很难，具体我也不太懂了，我觉得没有必要转天然质粒，你可以一段一段分析啊，国际通用方法都是一段段做的
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9楼2018-11-28 11:51:46
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snoopytbw

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8楼: Originally posted by lixiaoyu7 at 2018-11-27 11:24:46
谢谢，你用j53成功了吗，也是从野生株转移到j53吗，是肺克带有kpc这种不，可以告知一下具体的方法吗，不甚感激。
...

就是简单的工程质粒，把你要的靶序列PCR出来，测序，前后接头，转质粒，直接转化就结束了。工程质粒转的是J53，转KP有点难，就成功了一次，而且传代后就丢失了，KP需要用穿梭质粒做转基因
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10楼2018-11-28 11:53:44
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11楼: Originally posted by lixiaoyu7 at 2018-11-29 16:21:39
你好，你说的分段分析是指我做出质粒电泳，或者pfge后酶切然后把我要的质粒胶回收，再提出来，再进行电转吗？还想请教一下如果是低拷贝的大质粒，并且有很多个质粒，是不是就很难接合过去，我用电转也进不去。
...

天然有点难，一般条件比较苛刻，要试的。我意思是酶切后回收一段段的重组后表达，看看哪一段有耐药活性
你说的应该是S1-PFGE吧，那个是做质粒图谱，分质粒类型大小的，不一样。
其实最简单就是质粒分型后直接去测序，根本不用烦
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13楼2018-11-29 16:40:39
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snoopytbw

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11楼: Originally posted by lixiaoyu7 at 2018-11-29 16:21:39
你好，你说的分段分析是指我做出质粒电泳，或者pfge后酶切然后把我要的质粒胶回收，再提出来，再进行电转吗？还想请教一下如果是低拷贝的大质粒，并且有很多个质粒，是不是就很难接合过去，我用电转也进不去。
...

接合转移肯定只能是一种质粒啊，质粒不相容sir，如果你的受体菌是EC600，有些KP的质粒是不合适的，根本转不进去，干嘛非要转天然呢，你这样吧，S1-PFGE后，脉冲场电泳，一般用H9812做marker，看看条带几条，反正我做的几个都是只有1条，嘿嘿。。运气好吧，有的时候会有4～6条说不定呢，尤其ST11这种基因型，特别多。然后你每一个条带代表一种质粒，一个个胶回收，然后再去接合，说不定就成功了，成功的话，告诉我下，我下回也试试。。哈哈
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14楼2018-11-29 16:45:37
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15楼: Originally posted by lixiaoyu7 at 2018-11-30 12:23:00
好的谢谢谢谢，我的菌就是st11
...

你可以试试穿梭质粒，找如下几种，pKOBEG-Apra、pJTAG-Hyg、pFLP2-Apra，都是肺炎克雷伯HS11286的穿梭质粒，可以进行基因重组，不过质粒很难找到，我问了好多老外了，没一个肯送的。唉
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16楼2018-11-30 13:35:12
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17楼: Originally posted by lixiaoyu7 at 2018-12-06 16:42:45
大神，我问了一个做过这个的师兄，他说我可以试试用肺克做感受态电转，然后我刚才搜索好像看到大神你之前回复别人，做肺克的感受态可行吗对于我这种天然质粒来说，还有做肺克的感受态一般用什么菌呢，ATCC吗？谢谢 ...

肺克感受态有点难，不过可以做的，我是看到文献有人报道过，我自己没做出来，有点难。做出来粘粘的，都接不了平板，放弃了。我觉得实在不行就把靶基因扩全长，一段段去验证功能吧。或者扩几个基因一起做也可以。天然质粒的接合转移有点难，用电转的话，摸索条件就要做很久，关键每一株菌的敏感性都不一样，很头疼的。你要么一直用一株菌做感受态。试试吧，成功后教教我，嘿嘿。
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18楼2018-12-07 11:32:15
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17楼: Originally posted by lixiaoyu7 at 2018-12-06 16:42:45
大神，我问了一个做过这个的师兄，他说我可以试试用肺克做感受态电转，然后我刚才搜索好像看到大神你之前回复别人，做肺克的感受态可行吗对于我这种天然质粒来说，还有做肺克的感受态一般用什么菌呢，ATCC吗？谢谢 ...

我就用实验室现成的药敏标准菌株肺克做了一次，感受态是成功了，不过转进去重组质粒后，一直不表达，就没接着做。你可以用别的标准菌株试试，临床株还是别做了，太难
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19楼2018-12-07 11:44:59
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