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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 求助各位做过质粒接合实验的师兄师姐
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lixiaoyu7

新虫 (初入文坛)

[交流] 求助各位做过质粒接合实验的师兄师姐 已有4人参与

我做的是肺炎克雷伯菌转移到ec600我的肺克都带有kpc耐药基因，质粒的话最少都有两个质粒并且大小都在90kb，都是低拷贝质粒，已经做了几个月也没有筛到结合子，我用的是利福平300和亚胺2的量，单菌落增菌4h，然后调0.5麦氏，取供受1比2比例混合静止结合4h，取100ul涂板，对照板没有菌，双抗平板长出来的菌落再一次画到双抗平板上就没有了，这是什么原因呢，是我没结合成功，还是质粒结合不稳定，不能继续传代呢？请做过的师兄师姐帮忙看看，之前也做过一次电转，用的是dh5a制备感受态，质粒是用天跟试剂盒提取的，质粒电泳条带非常多，可能是本来细菌就有几个质粒然后质粒电泳又跑出了三种形态的原因，但是电转没有一株成功的，现在很迷茫，卡在这里好久了，后面实验也做不下去真的很无奈。

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1楼 2018-11-27 01:15:47
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biosci

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
直接电转化，别整三亲结合了，不靠谱

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2楼2018-11-27 07:44:51
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snoopytbw

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
肺炎克雷伯要用穿梭质粒做的，普通不行。专用的穿梭质粒要问老外要，有点烦，我也在问。老外不回邮件也是没办法
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3楼2018-11-27 08:54:09
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)
你受体菌是啥
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4楼2018-11-27 08:57:35
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)
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小冀-: 金币+3, 鼓励回帖，有帮助 2018-11-28 12:32:10
哦，看到了EC600，你试试J53吧，反正J53我成功了，另外，天然质粒不太好接合的，我用的还是工程。天然接合太难了。。。。有没有文献转过的呢，我没查到。。。
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5楼2018-11-27 09:00:02
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lixiaoyu7

新虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by snoopytbw at 2018-11-27 09:00:02
哦，看到了EC600，你试试J53吧，反正J53我成功了，另外，天然质粒不太好接合的，我用的还是工程。天然接合太难了。。。。有没有文献转过的呢，我没查到。。。

之前看到有文献转过的，但是自己就不成功，问过之前的师兄他们建议用ec600说比较简单，然后师兄说j53和电转对于肺克转大肠都比较难，你是自己做出来的工程菌转到野生株吗？我实验室有人做这个，他们用的电转，可以成功质粒大小是45kb感受态用dh5a

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6楼2018-11-27 11:18:07
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lixiaoyu7

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by biosci at 2018-11-27 07:44:51
直接电转化，别整三亲结合了，不靠谱

谢谢你的回复，我还想问问电转的话对感受态细胞要求高吗，比如要加氯化钙或者什么的，还有我提出来的质粒看质粒电泳也是有很多个的，都比较大，电转成功的几率也就受到影响了，所以第一次电转尝试并没有成功，之前你做过电转成功的吗可以告诉我具体的方法吗，谢谢。

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7楼2018-11-27 11:21:29
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lixiaoyu7

新虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by snoopytbw at 2018-11-27 09:00:02
哦，看到了EC600，你试试J53吧，反正J53我成功了，另外，天然质粒不太好接合的，我用的还是工程。天然接合太难了。。。。有没有文献转过的呢，我没查到。。。

谢谢，你用j53成功了吗，也是从野生株转移到j53吗，是肺克带有kpc这种不，可以告知一下具体的方法吗，不甚感激。

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8楼2018-11-27 11:24:46
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snoopytbw

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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6楼: Originally posted by lixiaoyu7 at 2018-11-27 11:18:07
之前看到有文献转过的，但是自己就不成功，问过之前的师兄他们建议用ec600说比较简单，然后师兄说j53和电转对于肺克转大肠都比较难，你是自己做出来的工程菌转到野生株吗？我实验室有人做这个，他们用的电转，可以 ...

工程质粒都比较简单，但是你这个天然质粒，很难，具体我也不太懂了，我觉得没有必要转天然质粒，你可以一段一段分析啊，国际通用方法都是一段段做的
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9楼2018-11-28 11:51:46
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snoopytbw

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8楼: Originally posted by lixiaoyu7 at 2018-11-27 11:24:46
谢谢，你用j53成功了吗，也是从野生株转移到j53吗，是肺克带有kpc这种不，可以告知一下具体的方法吗，不甚感激。
...

就是简单的工程质粒，把你要的靶序列PCR出来，测序，前后接头，转质粒，直接转化就结束了。工程质粒转的是J53，转KP有点难，就成功了一次，而且传代后就丢失了，KP需要用穿梭质粒做转基因
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10楼2018-11-28 11:53:44
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