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酿酒酵母麦角甾醇生物合成途径晚期基因的克隆
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对真菌中麦角甾醇生物合成途径的研究集中在鉴定正常膜结构和功能以及完成细胞周期所需的特定甾醇结构。该途径及其最终产品也是许多抗真菌药物的目标。鉴定ergo-sterol生物合成的基本步骤可为新型治疗剂的开发提供新的靶点。科学家们已经克隆了专门用于麦角甾醇生物合成途径部分中11个基因中的9个，并且已经确定了它们对有氧生长的必要性。前三个基因，ERG9（角鲨烯合成酶），ERG1（角鲨烯环氧酶）和ERG7（羊毛甾醇合成酶），已经克隆并发现其对于需氧活力是必需的，因为它们的缺失会导致细胞不能合成甾醇分子。剩下的8个基因编码代谢第一甾醇羊毛甾醇的酶，最终形成麦角甾醇。最早的两个基因ERG11（羊毛甾醇去甲基化酶）和ERG24（C-14还原酶）已被克隆并被发现对有氧生长至关重要，但分别被C-5去饱和酶（ERG3）基因和fen 1和fen2突变的突变所抑制。已发现剩余的克隆基因ERG6（C-24甲基化酶），ERG2（D8，ZE7异构酶），ERG3（C-5去饱和酶）和ERG4（C-24（28）还原酶）是非必需的。 尚未克隆的剩余基因是C-4去甲基化酶和C-22去饱和酶（ERGS）。 几十年来，人们对真核细胞中的甾醇生物合成进行了深入研究。现在动物，植物和真菌甾醇的生物合成途径已经有了明确定义，并且已经充分证明了动物细胞中胆固醇生物合成的调节。 对产生C28甾醇，麦角甾醇作为其最终产品的真菌甾醇途径的研究遵循两个主要的研究方向。其中第一个旨在回答有关甾醇在膜结构和功能中的作用的基本问题。 使用各种系统，甾醇已被证明在维持适当的膜流动性，调节方面发挥着关键作用的膜渗透性，影响膜结合酶的活性，并改变细胞生长速率。 除了这些与膜相关的功能，甾醇还涉及在细胞周期中提供基本功能，在激素水平（10nM）下需要具有特定结构特征的固醇以允许细胞周期完成。科学家们已经在酵母和动物细胞中证明了这种现象，阐明这种甾醇功能以及甾醇分子是最近研究的主题。真菌甾醇研究的第二个重点是需要开发用于医药和农业的新型抗真菌剂。近期人类真菌感染人数的快速增加令人担忧，真菌感染可能导致免疫抑制疾病发病率增加和技术进步引起的免疫抑制增加等。 作为真核生物，真菌病原体几乎没有潜在的治疗靶点，使宿主不受影响。目前可用的治疗剂对微生物抗性的增加已经在从基础科学期刊到产品报刊的不同出版物中被引用，虽然许多这些文章的重点是细菌抗性，但是所有官方批准的抗真菌剂都有重大缺陷，限制了它们的有效使用。另外一个结果是，一些最好的真菌抗生素是真菌而不是杀真菌的。加上免疫抑制疾病、化疗和移植的医学进步，所有这些都导致或需要免疫抑制，真菌抑制化合物仅仅延迟病原体，然后必须通过非功能性免疫应答来控制病原体。人类免疫缺陷病毒感染是一个特别重要的领域，其中目前可用的抗真菌剂效力有限。因此，可以提供甾醇合成中必需步骤的鉴定可能改善抗真菌活性的新药的理想目标。 抗真菌化合物的主要目标包括麦角甾醇及其生物合成。有许多药物特异性地阻断麦角甾醇的生物合成，对宿主胆固醇合成几乎没有影响。特异性基于差异酶敏感性或细胞渗透性的差异。在许多情况下，不良副作用是由宿主酶的抑制而引起的。烯丙胺类可抑制角鲨烯环氧酶，即在合成第一甾醇分子之前的途径中出现的酶（图1）。这些化合物主要局限于局部应用，并且对产生危及生命的全身性感染的病原体几乎没有活性。吗啉是一组甾醇生物合成抑制剂（SBI），其阻断甾醇合成，C-14甾醇还原（ERG24）和甾醇A8 - +7异构化（ERG2）中的两个独立步骤。该组主要用于农业应用，尽管阿莫罗芬正在接受人类局部使用的调查，唑类（咪唑和三唑）是最广泛使用的SBI，并且可用于局部或者全身，这些化合物抑制羊毛甾醇（ERG11基因产物）的C-14去甲基化，导致C-14甲基甾醇的形成。作为麦角甾醇的替代品，这些甾醇产生膜效应，导致膜流动性降低，并且使侵入性菌丝体的能力降低，这是真菌发病机理中的重要特征。抗真菌剂的多烯基团选择性地与膜麦角甾醇相互作用并引入必需细胞成分逃逸的通道，导致细胞死亡。由于它们的疏水性和代谢，一些多烯，例如制霉菌素，仅限于局部应用，其他如两性霉素B可以全身使用，但会产生严重的副作用。  尽管不被认为是主要病原体，酿酒酵母已经被用作阐明麦角甾醇途径的模型系统，并且在该生物体中有可能确定负责某些酶促步骤的基因的必需性。酵母具有确定的生命周期和有性繁殖的优点，使单倍体存在和遗传杂交常规。使用致病性真菌（例如白色念珠菌）的进展相当慢，并且在很大程度上取决于来自酿酒酵母的程序和信息。 该综述将重点关注该途径的后半部分，从合成角鲨烯开始，角鲨烯是羊毛甾醇的前体，羊毛甾醇是该途径中的第一个甾醇中间体（图1）。角鲨烯形成之前的步骤对于途径调节是十分重要的，并且早期途径中间体被代谢以产生其他必需的细胞组分。负责编码的11种酶中的9种的基因已经克隆了角鲨烯中的麦角甾醇部分，并确定了各自对有氧生长的必要性。对于从羊毛甾醇到麦角甾醇的生物合成步骤，通过基因破坏确定必需性，然后在有氧条件下进行等位基因置换和生长。从角鲨烯形成到羊毛甾醇合成的步骤中的嵌段是必要的，因为它们不允许形成任何甾醇分子。表1列出了从羊毛甾醇形成到麦角甾醇的11种反应，以及已知的所涉及的基因，它们对需氧生长的必要性，它们的染色体位置和抑制基因产物的药物。 尚未克隆指定负责11个步骤中的两个步骤的酶的基因。 这些包括编码负责去除两个庞大的C-4甲基的酶的基因和用于在C-22位置（ERG5）的侧链去饱和的基因。  ERG9 角鲨烯是麦角甾醇生物合成中的第一个甾醇前体，由角鲨烯合成酶（法呢基二磷酸法呢基转移酶）由两个法呢基二磷酸分子形成。该反应的底物为法呢基二磷酸盐是合成具有类异戊二烯组分的其他几种重要分子的起始化合物。因此，ERG9基因产物的作用代表了致力于甾醇合成的分支中的第一反应。两个实验室报道了ERG9基因的克隆。在两项研究中，erg9甾醇营养缺陷型含有允许有氧摄取甾醇的标记物用野生型酵母基因组文库转化。选择能够无需麦角甾醇补充的有氧生长的转化体。含有ERG9基因的质粒在erg9细胞以及大肠杆菌中产生角鲨烯合成酶活性。插入DNA的表征表明编码44n氨基酸蛋白的开放阅读框，其分子量约为51,700。这种酶在酵母和人类之间高度保守。ERG9基因已经定位于8号染色体。 ERG1 ERG1基因的产物是一种需要氧的酶，它将角鲨烯转化为2,3-氧化角鲨烯，它是羊毛甾醇的直接前体。该酶对烯丙胺的抑制敏感，这种特性已被用于克隆ERG1。使用酿酒酵母的烯丙胺抗性突变体（基于酶抗性）构建用于转化野生型亲本菌株的文库。然后基于对药物的抗性分离转化体。分析含有erg1等位基因的质粒，发现其含有编码496个氨基酸的蛋白质的开放阅读框。ERG1基因已定位于15号染色体。 ERG7 编码2,3-氧化角鲨烯环化酶或羊毛甾醇合成酶的ERG7基因已从白色念珠菌和最近的酿酒酵母中克隆。编码植物酶的类似基因，环多烯醇合酶，其在植物甾醇合成中进行平行步骤，也已从拟南芥中克隆。在酿酒酵母中，使用衍生自念珠菌和拟南芥ERG7基因产物的保守氨基酸序列的寡核苷酸引物进行酵母基因组DNA的聚合酶链反应（PCR）扩增。然后使用PCR产物探测cDNA和基因组文库，但没有鉴定出全长序列，可能是因为该序列在大肠杆菌中不稳定。最终，利用两个重叠克隆重建整个编码序列。该基因包含一个2196bp的开放阅读框 对应于732个氨基酸的蛋白质。与形成甾醇分子之前的其他基因的情况一样，ERG7是需氧活力所必需的。通过使用野生型白色念珠菌文库克隆念珠菌ERG7基因以补充酿酒酵母的erg7突变体。ERG7已被定位于酿酒酵母中的染色体8。 ERG11 ERG11基因的产物是细胞色素P-450去甲基化酶，其负责从C-14位置除去甲基。 已经报道了几种有氧生存的ergll突变体，但都发现它们都是渗漏的，并且伴随着ERG3基因的第二个突变，其产物在该途径的后期在C-5位置（C-5去饱和酶）引入双键。ERGll基因的必要性在被Kalb等人克隆和表征之前是有问题的。通过用高拷贝数质粒中的酵母基因组文库转化酵母并筛选转化体对唑类，酮康唑（C-14去甲基化酶的特异性抑制剂）的抗性来完成克隆,随后的分析表明530个氨基酸的蛋白质。编码脱甲基酶的基因已经定位于8号染色体。 erg3突变体对ERGll必需性的抑制仍然是个问题。最近，Bard等人。已经表明ERG11和ERG3的双重破坏在需氧条件下是可行的，这表明去除C-14甲基不是必需的步骤。Watson et al的假设解释了erg3对ergll表型的抑制作用。由于甾醇途径的酶显示出高水平的底物不忠性，因此封闭步骤后的酶将继续催化可用的甾醇中间体。在这种情况下，C-14甲基甾醇继续向下通往C-5去饱和酶的途径，该去饱和酶试图使C-5位置去饱和但无法完成此过程。这种中止的努力的结果是形成中间体，14α-methyl-ergosta-8,24(28)-diene-3β,6α-diol，提出了一种甾醇破坏膜结构和功能导致细胞死亡的假设。这种二醇已经在白色念珠菌的ergll突变体中被鉴定出来并且被该生物体耐受。这种差异可能是膜结构中细微变化的结果，或者可能反映了两种物种中毒性甾醇酯化的替代机制。 ERG24 C-14去甲基化酶反应产物4,4-二甲基 - 胆甾-8,14,24-三烯醇在C-14位被还原，通过作用形成4,4-二甲基胆甾-8,24-二烯醇ERG24基因的产物。 C-14还原酶是吗啉抗生素抑制的两个位点之一，这一特征被一组用于克隆ERG24。使用类似于克隆中使用的策略在高拷贝数质粒中用酵母基因组文库转化ERG11，酿酒酵母，并筛选所得转化体对苯甲酰胺（一种吗啉）的抗性。确认抗性是由于C-14还原酶的过量产生。随后的基因破坏和等位基因置换导致菌株在氧气存在下不能生长。解决这个问题在这些条件下的不可靠性是由于有毒甾醇中间体（主要是甾醇，ergosta-8,14-二烯醇）的积累还是由于缺乏具有必要结构特征的甾醇，在遗传背景中尝试进行有氧生长以允许摄取含有麦角甾醇的培养基上的外源性甾醇，从结果看来其确实发生了增长，科学家们认为点燃甾醇不会阻碍有氧生长。 同时，第二个研究小组使用一种聪明的替代策略克隆了C-14还原酶。该组选择具有两种隐性突变的fenproprimorph抗性突变体fenl和fen2。当药物不存在时，野生型和抗性突变体都产生麦角甾醇，并且当它存在时产生偶氮甾醇。fen1和fen2突变的存在允许产生细胞的存活只有点燃甾醇。通过诱变产生携带fen1和fen2的菌株的制霉菌素抗性分离物并筛选点燃甾醇的积累。获得一种这样的分离物。通过用野生型酵母基因组文库和选择产生麦角甾醇的制霉菌素敏感性分离物转化抗ny-他汀抗性，产生甾醇的fen1，fen2菌株来克隆ERG24基因。表征了赋予所需表型的质粒，并推导出编码分子量为50,612的438个氨基酸蛋白质的1314bp开放阅读框。该基因尚未定位。 第三个研究小组最近报道了ERG24基因的克隆和鉴定。使用的方法类似于Marcireau等人使用的方法。序列分析证实了以前报告的结论。此外，该研究报道了ERG24，Schizosaccharomyces pombe的stsl+基因和酿酒酵母的YGL022基因之间的序列相似性。后两个基因及其与麦角甾醇途径的关系在本综述的ERG4部分进行了讨论。 ERG6 ERG6基因的产物甲基化酵母甾醇的C-24位置，产生大多数真菌常见的28碳甾醇结构。 C-24甲基化被认为是功能性甾醇合成中的必需步骤。然而，由于只需要激素量的“必需”甾醇，因此难以绝对证明这一假设。最终使用erg6突变体通过互补克隆ERG6基因。使用erg6菌株的克隆存在技术困难，因为细胞膜功能受到未甲基化甾醇的存在的显着影响，导致低转化率和降低的交配效率。需要进行重大的协议更改用酵母基因组文库成功转化erg6并选择对环己酰亚胺不敏感的克隆（erg6中的渗透性缺陷导致对该药物的敏感性增加）。野生型环己酰亚胺抗性的恢复是erg6互补的有效初始筛选。然后测定转化体的麦角甾醇产量和制霉菌素敏感性。 在用于通过转化替换野生型ERG6基因的质粒上构建ERG6基因的两个缺失 - 取代，其中插入ERG6基因的LEU2基因提供了选择标记。这些破坏的菌株是可行的。 随后的报告表明，抑制ERD2突变形式的基因SED6（参与从内质网中回收蛋白质的基因）与ERG6基因相同。ERG6基因已定位于13号染色体上。 ERG2 △8 →7异构酶是ERG2基因的产物，是吗啉抗生素的靶标之一。基于这些药物的功效，有人建议这一步骤可能是必要的。使用与ERG6相同的方案，用酵母基因组文库转化erg2突变体并筛选环己酰亚胺抗性。赋予麦角甾醇合成的功能性质粒插入物的序列分析表明编码222个氨基酸的蛋白质的开放阅读框。编码序列的破坏不影响生存力，表明该基因不是必需的。ERG2基因也已经定位于13号染色体。 ERG3 作为ERG3基因的产物的C-5去饱和酶将episterol [ergosta-7,24（28）-二烯醇]转化为ergosta-5,7,24（8）三烯醇。基于喂养实验，Parks和同事得出结论，只有含有C-5不饱和度或经历这种改变的能力的甾醇才能提供必需的甾醇功能。使用转化，选择和转化方案克隆ERG3基因验证与ERG6和ERG2的验证相同。ERG3基因的测序表明365个氨基酸的蛋白质。 通过缺失和取代确定ERG3的必需性，携带含有缺失和破坏的等位基因的菌株是可行的。 ERG3基因位于酵母染色体12上。 ERG4 ERG4基因提供了降低C-24双键的酶，这是麦角甾醇生物合成的最后一步。使用克隆在该途径中较早操作的基因的方案，不可能直接克隆该基因。在erg4突变体中积累的甾醇在结构上与麦角甾醇相似，并且甾醇取代的作用不足以区分突变体和野生型，基于渗透性或抗生素敏感性的差异。最近，ERG24的序列显示与报道的粟酒裂殖酵母的stsl+基因，酿酒酵母的YGL022基因和鸡核纤层蛋白B受体基因。基于C-24甾醇的积累，确定stsl+和YGL022含有C-24还原酶中的缺陷。此外，YGL022的破坏显示为erg4突变体的等位基因。科学家们因此得出结论，YGL022是ERG4，并且还原酶对于活力不是必需的。图2显示了ERG24和ERG4基因产物的氨基酸序列。ERG4已定位于7号染色体。 剩余的基因 尚未在麦角甾醇生物合成中克隆的剩余两个步骤包括ERG5基因和C-4去甲基化酶基因。 后一种基因很有意思，因为没有使用标准多烯抗性选择检测到突变体程序。这可能意味着不能去甲基化可能导致甾醇中间体的积累，这对于膜中的功能性包含是不可接受的，或者所得的甾醇可能不具有必需的结构功能提供必要的细胞周期功能。C-4去甲基化的过程是复杂的，涉及三种不同的氧化酶，脱羧酶和3-酮还原酶。虽然已经描述了胆固醇途径中的对应反应，但对酵母酶的研究还很少。 |
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