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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 如何以质粒为模板PCR？
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x8q4h11

木虫 (小有名气)

[交流] 如何以质粒为模板PCR？

各位虫友，大家好。我想以质粒（目的基因连到T载体）做模板做PCR，大家给推荐一下质粒稀释倍数吧，谢谢。最下面是marker,上面是目的基因和质粒。

[ Last edited by 350784478 on 2009-10-2 at 15:11 ]
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1楼 2009-04-20 16:36:58
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hbxjh1984

铜虫 (初入文坛)

为什么要提质粒呢？

我构建的细菌克隆文库，也是连接在T载体上，培养的液体大肠杆菌克隆子25微升体系加2微升菌液就可以了！
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2楼2009-04-20 16:47:13
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
1000倍
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3楼2009-04-20 19:53:13
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)
直接取0.5-1微升做模版，不用稀释也行
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4楼2009-04-20 20:10:59
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x8q4h11

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by hbxjh1984 at 2009-4-20 16:47:
我构建的细菌克隆文库，也是连接在T载体上，培养的液体大肠杆菌克隆子25微升体系加2微升菌液就可以了！

谢谢。我开始的时候用菌液PCR检测阳性克隆，是P出来了，可是之后用同一菌液、同样的体系就是P不出来，所以想用质粒做模板，毕竟质粒比菌液纯多了……不知道要稀释多少倍……
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5楼2009-04-20 20:51:13
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x8q4h11

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by guoqin_shiyin at 2009-4-20 20:10:
直接取0.5-1微升做模版，不用稀释也行

谢谢。不过不稀释的话模板浓度太高了吧?
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6楼2009-04-20 20:52:30
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
估计lz拿到的是连T载保存的目的基因。
我遇到和楼主相同的情况，从跑胶情况看稀释20-40倍25ul体系加1ul模板p试试。
实在不行，多稀释几个倍数分别做做，看那种效果好。
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Thank-you，so-blue.
7楼2009-04-20 20:54:32
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x8q4h11

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2009-4-20 20:54:
估计lz拿到的是连T载保存的目的基因。
我遇到和楼主相同的情况，从跑胶情况看稀释20-40倍25ul体系加1ul模板p试试。
实在不行，多稀释几个倍数分别做做，看那种效果好。

谢谢
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8楼2009-04-20 21:13:33
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)
浓度高有什么关系，只要能扩增出目的基因就行了。
我一般取0.5微升直接扩增的。如果你觉得浓度还高，取0.3就够了。
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9楼2009-04-20 22:44:04
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x8q4h11

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by guoqin_shiyin at 2009-4-20 22:44:
浓度高有什么关系，只要能扩增出目的基因就行了。
我一般取0.5微升直接扩增的。如果你觉得浓度还高，取0.3就够了。

谢谢
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10楼2009-04-21 11:05:10
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