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董红红

铜虫 (小有名气)

[求助] pcambia1304植物表达载体构建 已有1人参与

最近打算构建一些植物表达载体，用的载体是pcambia1304，遇到的问题如下：
1插入的片段应该是在多克隆位点处还是35S启动子后面？
2.如果插入到多克隆位点的话基因没有启动子，前面只有一个lac启动子和操纵子，这个基因能正常表达吗？
3.如果插在35S启动子后面，那么原先35S后面的GFP和GUS还能正常表达吗？
4。如果是自己在多克隆位点处引入基因的启动子，那加基因自身的启动子好还是加一个强启动子就可以？加什么启动子比较好？
还请路过的大神指点，不甚感激

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1楼 2018-11-13 01:13:01
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董红红

铜虫 (小有名气)
还有一个问题，这个载体上有两个35S启动子，测序时没法用35S的通用引物，请问做过的大神们一般用什么引物测序呀？

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2楼2018-11-13 01:15:12
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海阔天空_812

新虫 (小有名气)
★
董红红(liouzhan654代发): 金币+1, 感谢交流 2018-11-13 11:45:47
应该是35S启动子好一些，其次，多克隆位点前没有35S的话基因不要插，要不然无法启动自己基因的表达，也就是不能融合表达。将自己的基因插在35S后，GUS基因前，要么改造载体，在多克隆位点前加35S启动子。

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3楼2018-11-13 01:19:39
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老毛桃11

新虫 (知名作家)
加35s 然后再加个nos终止，我刚改造完

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4楼2018-11-13 07:46:43
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董红红

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 老毛桃11 at 2018-11-13 07:46:43
加35s 然后再加个nos终止，我刚改造完

这个载体上本来已有2个35S启动子，如果再加一个的话，那就3个35S启动子了，这样会不会后面测序的时候不好测？

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5楼2018-11-13 18:29:55
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老毛桃11

新虫 (知名作家)
没办法啊，你不加就得融合表达了！

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6楼2018-11-13 18:39:44
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梦弋惊龙

铁杆木虫 (著名写手)

***

【答案】应助回帖

该植物过表达质粒，含有两个35S启动子，一个是增强型35S，其主要目的就是在植物中增强目的基因的表达，另一个35S启动子的目的是启动GFP和GUS报告基因的，所以两个35S启动子目的不同。片段要插入多克隆位点，该质粒含有lacZa，是可以进行蓝白斑筛选的。该质粒在MCS上下游是含有M13通用引物序列的，可以使用M13测序！
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******
7楼2019-03-01 18:59:26
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