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董红红

铜虫 (小有名气)

[求助] pcambia1304植物表达载体构建 已有1人参与

最近打算构建一些植物表达载体,用的载体是pcambia1304,遇到的问题如下:
1插入的片段应该是在多克隆位点处还是35S启动子后面?
2.如果插入到多克隆位点的话基因没有启动子,前面只有一个lac启动子和操纵子,这个基因能正常表达吗?
3.如果插在35S启动子后面,那么原先35S后面的GFP和GUS还能正常表达吗?
4。如果是自己在多克隆位点处引入基因的启动子,那加基因自身的启动子好还是加一个强启动子就可以?加什么启动子比较好?
还请路过的大神指点,不甚感激

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董红红

铜虫 (小有名气)

还有一个问题,这个载体上有两个35S启动子,测序时没法用35S的通用引物,请问做过的大神们一般用什么引物测序呀?

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2楼2018-11-13 01:15:12
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海阔天空_812

新虫 (小有名气)


董红红(liouzhan654代发): 金币+1, 感谢交流 2018-11-13 11:45:47
应该是35S启动子好一些,其次,多克隆位点前没有35S的话基因不要插,要不然无法启动自己基因的表达,也就是不能融合表达。将自己的基因插在35S后,GUS基因前,要么改造载体,在多克隆位点前加35S启动子。

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3楼2018-11-13 01:19:39
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老毛桃11

新虫 (知名作家)

加35s 然后再加个nos终止,我刚改造完

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4楼2018-11-13 07:46:43
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董红红

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 老毛桃11 at 2018-11-13 07:46:43
加35s 然后再加个nos终止,我刚改造完

这个载体上本来已有2个35S启动子,如果再加一个的话,那就3个35S启动子了,这样会不会后面测序的时候不好测?

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5楼2018-11-13 18:29:55
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老毛桃11

新虫 (知名作家)

没办法啊,你不加就得融合表达了!

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6楼2018-11-13 18:39:44
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梦弋惊龙

铁杆木虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

该植物过表达质粒,含有两个35S启动子,一个是增强型35S,其主要目的就是在植物中增强目的基因的表达,另一个35S启动子的目的是启动GFP和GUS报告基因的,所以两个35S启动子目的不同。片段要插入多克隆位点,该质粒含有lacZa,是可以进行蓝白斑筛选的。该质粒在MCS上下游是含有M13通用引物序列的,可以使用M13测序!
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7楼2019-03-01 18:59:26
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