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cathyl_7

铜虫 (小有名气)

[交流] CO-IP问题求助

研究蛋白-蛋白相互作用时,用co-immunoprecipitation 即免疫共沉淀方法。
问题(1) 2个蛋白A与B进行相互作用的验证,用双向CO-IP。A蛋白 IP B蛋白时,结果成阳性;但反过来,用B蛋白 IP A蛋白 时,结果为阴性。这样的结果,说明A与B有没有相互作用啊,大家有没有遇到过这样的情况?

问题(2)在做Western Blotting 时,lysate检测不到,而IP可以检测到。不论自身IP还 是被IP的蛋白都出现过这种情况。且只是有时候。不清楚原因

[ Last edited by 350784478 on 2009-9-19 at 13:17 ]
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

难道是抗体有问题?有些抗体是不适合做IP只能做WB的,得仔细看看说明书
2楼2009-04-15 13:35:49
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cathyl_7

铜虫 (小有名气)

抗体应该没问题,同样的抗体,也做别的IP,有阳性结果。只是正反IP的时候,结果不一致,不知道大家有没有遇到过这种情况

以前听别人也遇到过,但都不知道怎么解决,在这求助大家啊。谢谢
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3楼2009-04-15 15:45:12
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cathyl_7

铜虫 (小有名气)

顶一下,有虫友知道原因吗,不胜感激啊?
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4楼2009-04-16 09:39:52
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dukemiles

木虫 (小有名气)

两种蛋白本身的差异不知楼主是否考虑过
''theperfectsolutionistheimperfection''
5楼2009-04-16 15:53:51
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cathyl_7

铜虫 (小有名气)

楼上是指蛋白大小差异吗

A/B两个蛋白都差不多40,50kDa。应该不存在一个分子量太大,一个分子量太小,太小的很难把大蛋白IP下来的情况

如果不是这种差异,楼上的意思是?
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6楼2009-04-16 18:09:22
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dukemiles

木虫 (小有名气)

结构和丰度呢?

CO-IP不太容易出的,方法本身没问题的话,楼主不妨多试几次
''theperfectsolutionistheimperfection''
7楼2009-04-17 08:15:49
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cathyl_7

铜虫 (小有名气)

我做的是外源实验,全都是外转质粒。丰度应该不用考虑,蛋白表达也没什么问题

至于结构,如果A蛋白可以IP B蛋白的话,它们应该具备相互结合的结构域或条件吧

B蛋白IP A蛋白,都做了十几次了啊

所以求助大家,谢谢
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8楼2009-04-17 10:01:32
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cathyl_7

铜虫 (小有名气)

顶一下,有经验之人,提供点帮助吧,谢谢啊!
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9楼2009-04-17 22:33:36
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