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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » EMSA/ChIP » 载体构不上去
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梦3建

新虫 (初入文坛)

[求助] 载体构不上去 已有1人参与

最近构了一个块三个月的载体，一直没有连上去，连的片段5K，载体11K，重组，酶切，TA克隆都没有做成，菌落PCR假阳性很高，球有经验人士指点指点。
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1楼 2018-11-09 23:13:00
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安大白

新虫 (初入文坛)
我都构一年了

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2楼2018-11-09 23:36:43
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安静de执着14

新虫 (著名写手)
★ ★
梦3建(渊博震天代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2018-11-10 08:49:02
换比较好的内切酶和连接酶，酶连时间长一些，问题应该不大。

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3楼2018-11-09 23:47:30
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梦3建

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 安静de执着14 at 2018-11-09 23:47:30
换比较好的内切酶和连接酶，酶连时间长一些，问题应该不大。

都试过了，还是连不上，想问一下重组的时候同源部分的GC含量太高会不会有影响，只是指是同源部分。
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4楼2018-11-10 10:22:26
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)
会有影响，可能会形成高级结构或者乱连，若Tm值远高于你的重组温度。

要不要考虑丢给我来连
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5楼2018-11-10 10:51:30
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好运连连OK

新虫 (小有名气)
片段不要纯化直接跟载体连接试试

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6楼2018-11-10 14:03:34
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安静de执着14

新虫 (著名写手)
★
drwhoknowss: 金币+1, 鼓励交流 2018-11-10 22:45:01
我曾经连过7K的目的基因与5k的载体，酶连4个多小时，成功率挺高的，所以我建议你选择合适的酶连温度连接时间长一些。还有就是转化后所有的菌液离心后去除大部分上清后涂布。

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7楼2018-11-10 14:22:01
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灵殊9999

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 好运连连OK at 2018-11-10 14:03:34
片段不要纯化直接跟载体连接试试

你这样做成功过吗？我也想试试。
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8楼2018-11-13 09:14:29
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灵殊9999

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 安静de执着14 at 2018-11-10 14:22:01
我曾经连过7K的目的基因与5k的载体，酶连4个多小时，成功率挺高的，所以我建议你选择合适的酶连温度连接时间长一些。还有就是转化后所有的菌液离心后去除大部分上清后涂布。
...

相邻的酶切位点，估计概率也是低的要命啊！
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9楼2018-11-13 09:16:19
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御风（远）

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

首先确定酶切知道的靶片段和载体质量没问题。酶切时间很重要，有些酶酶切个十几到三十几分钟就够了，酶切时间不是随便搞得，别把目的片段或者载体切烂了，当然做不出来，至于酶连反应，通常4℃连接过夜就好。
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10楼2018-11-20 17:15:49
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