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梦3建

新虫 (初入文坛)

[求助] 载体构不上去 已有1人参与

最近构了一个块三个月的载体,一直没有连上去,连的片段5K,载体11K,重组,酶切,TA克隆都没有做成,菌落PCR假阳性很高,球有经验人士指点指点。
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安大白

新虫 (初入文坛)

2楼2018-11-09 23:36:43
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安静de执着14

新虫 (著名写手)

★ ★
梦3建(渊博震天代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2018-11-10 08:49:02
换比较好的内切酶和连接酶,酶连时间长一些,问题应该不大。

发自小木虫Android客户端
3楼2018-11-09 23:47:30
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梦3建

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 安静de执着14 at 2018-11-09 23:47:30
换比较好的内切酶和连接酶,酶连时间长一些,问题应该不大。

都试过了,还是连不上,想问一下重组的时候同源部分的GC含量太高会不会有影响,只是指是同源部分。
4楼2018-11-10 10:22:26
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

会有影响,可能会形成高级结构或者乱连,若Tm值远高于你的重组温度。

要不要考虑丢给我来连
5楼2018-11-10 10:51:30
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好运连连OK

新虫 (小有名气)

片段不要纯化直接跟载体连接试试

发自小木虫Android客户端
6楼2018-11-10 14:03:34
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安静de执着14

新虫 (著名写手)


drwhoknowss: 金币+1, 鼓励交流 2018-11-10 22:45:01
我曾经连过7K的目的基因与5k的载体,酶连4个多小时,成功率挺高的,所以我建议你选择合适的酶连温度连接时间长一些。还有就是转化后所有的菌液离心后去除大部分上清后涂布。

发自小木虫Android客户端
7楼2018-11-10 14:22:01
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灵殊9999

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 好运连连OK at 2018-11-10 14:03:34
片段不要纯化直接跟载体连接试试

你这样做成功过吗?我也想试试。
8楼2018-11-13 09:14:29
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灵殊9999

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 安静de执着14 at 2018-11-10 14:22:01
我曾经连过7K的目的基因与5k的载体,酶连4个多小时,成功率挺高的,所以我建议你选择合适的酶连温度连接时间长一些。还有就是转化后所有的菌液离心后去除大部分上清后涂布。
...

相邻的酶切位点,估计概率也是低的要命啊!
9楼2018-11-13 09:16:19
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御风(远)

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

首先确定酶切知道的靶片段和载体质量没问题。酶切时间很重要,有些酶酶切个十几到三十几分钟就够了,酶切时间不是随便搞得,别把目的片段或者载体切烂了,当然做不出来,至于酶连反应,通常4℃连接过夜就好。
10楼2018-11-20 17:15:49
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