真菌原生质体crisper 基因敲除 - 分子生物 - 干扰/敲除

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752261407

新虫 (小有名气)

MolEPI: 1
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在线: 8.4小时
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
渊博震天: 金币+15, MolEPI+1, 鼓励有价值的回帖 2018-11-09 07:37:07

引用回帖:

9楼: Originally posted by 上官海泠 at 2018-10-06 10:30:24
抗性基因整合在质粒上的。现在有重新做了一批直接涂在抗性平板上了，在500ug/ml 潮霉素下没有长出菌落；但是处理组两天内在0-50ug/ml 都长出大量（一片）的单菌落，50-100 ug/ml 有少量单菌落生长出来。现在在筛 ...

1，首先确定的是，你这个真菌是否基因组或转录组测序验证本身是否存在潮霉素抗性，这个是首先要确定的，如果存在，就不能以这个抗性为做为筛选标记。2，真菌的潮霉素抗性筛选方式，不知道您进行潮霉素梯度筛选时，是接种的一块菌落，还是将菌丝稀释之后用涂布棒涂板，如果是前者，建议在不同潮霉素抗性浓度梯度下，接种同样大小的菌落；如果是后者，建议稀释倍数一样，这样能保证定量。3，真菌不像细菌那样对于抗性的筛选条件稳定，真菌接种到抗性平板上，建议以一个周为筛选周期，观察菌落在不同浓度潮霉素抗性下的生长情况，从而确定最适筛选浓度。（三天太短，后期会陆陆续续长出来假阳性）。4，可否告知一下质粒是什么质粒，因为大部分细菌质粒，都包含细菌的复制子，所以能够稳定遗传复制，而丝状真菌复制子较少，目前我多了解的只有AMA1复制子，是构巢曲霉的复制子，从而保障质粒在丝状真菌中能够稳定传代。由于目前报道的很多文章都没有涉及到复制子的问题，很对文章大部分都是把cas9整合到丝状真菌基因组上才能够保证稳定存在，所以这个方面是一个很关键的因素。因为你的潮霉素基因存在于质粒上，如果该质粒没有真菌复制子，那很有可能传代1次，该质粒就会消失，所以不可能达到质粒稳定遗传的目的，更谈不上敲除了，或者说你的目的是将潮霉素或者cas9整合到基因组上，你要看一下利用的是位点特异性重组还是同源重组。5，真菌的筛选很不稳定，建议不要只考虑潮霉素这一个抗性筛选标记，可选择其他类型的抗性筛选标记，可查阅相关文献。6，刚才你说的这种筛选情况，我觉得应该是400为筛选条件，并进行多伦筛选，才能够筛选到单一突变的菌落。另外，丝状真菌还有一个特殊之处在于，它的菌丝是多核的，即菌丝里面可能包含多个细胞核，即使你幸运敲除成功了几个，还需要多轮筛选才能得到单一的突变体，所以抗性筛选标记和敲除质粒很关键。

发自小木虫Android客户端

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上官海泠

10楼2018-10-09 09:06:55

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