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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 真菌原生质体crisper 基因敲除
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上官海泠

金虫 (小有名气)

[交流] 真菌原生质体crisper 基因敲除

楼主做了一批原生质体转化子（用crisper体系，潮霉素B是筛选抗性），现在转化子在无抗性的平板上长出来了；但是长得太密集了，现在想从这些转化子里晒出来阳性克隆，请问各位同仁有什么好办法？楼主想到用影印培养法，但是工具（小圆木）不好买而且不知效果。
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1楼2018-09-30 11:18:30
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上官海泠

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
10楼: Originally posted by 752261407 at 2018-10-09 09:06:55
1，首先确定的是，你这个真菌是否基因组或转录组测序验证本身是否存在潮霉素抗性，这个是首先要确定的，如果存在，就不能以这个抗性为做为筛选标记。2，真菌的潮霉素抗性筛选方式，不知道您进行潮霉素梯度筛选时， ...

1. 这个种属的丝状真菌有文献已经报道过，并且已经利用这个技术成功获得了阳性克隆株。他们用的也确实是500ug/ml的潮霉素抗性。2. 筛选用的是再生的原生质体，涂板的浓度一致。3.三天时间确实出现了很多假阳性，原本没长出来的全部长出来了。4.用的是慢病毒质粒（用的也是已报到的质粒），ef1a启动子启动cas9，U6启动子启动sgRNA 5.目前质粒构建的是潮霉素抗性，有人用过嘌呤霉素 评价效果不佳6.所以现在这一批，感觉还是假阳性的多；需要用400的浓度去筛选。这批400和500浓度的都没有长出来，超过一个星期了。
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11楼2018-10-09 15:27:16
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上官海泠

金虫 (小有名气)
no useful answer ？？？
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7楼2018-10-01 17:12:34
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752261407

新虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
渊博震天: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-10-04 19:55:24
渊博震天: 金币+3, 鼓励回帖交流 2018-11-09 09:03:04
1建议挑取部分菌丝或者是能明显看到的颗粒状真菌，用水适当稀释，再次接种到潮霉素抗性平板筛选（如果条件允许可以适当提高潮霉素抗性浓度），筛选几轮，即可得到单菌落。不知楼主是将潮霉素抗性基因整合到基因组上还是在质粒上的形式存在？

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上官海泠
8楼2018-10-04 16:23:26
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上官海泠

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by 752261407 at 2018-10-04 16:23:26
1建议挑取部分菌丝或者是能明显看到的颗粒状真菌，用水适当稀释，再次接种到潮霉素抗性平板筛选（如果条件允许可以适当提高潮霉素抗性浓度），筛选几轮，即可得到单菌落。不知楼主是将潮霉素抗性基因整合到基因组上 ...

抗性基因整合在质粒上的。 现在有重新做了一批直接涂在抗性平板上了，在500ug/ml 潮霉素下 没有长出菌落；但是处理组两天内在0-50ug/ml 都长出大量（一片）的单菌落，50-100 ug/ml 有少量单菌落生长出来。现在在筛选这些单菌落…… 但是，这里有个问题，我做的对照组（阴性，不加质粒） 0-70 ug/ml 抗性下，（放置两天）生长量依次降低，80以上就基本不长了，再放置到第五天时80-100的也长出来了。之前，做过100-500的梯度，只有放置超过三天，100-300才会有几个阴性菌落长出来，400以上不生长。所以想问，我应该用什么浓度去筛选阳性克隆？最下抑制浓度是80还是400？  现在我以80浓度，生长两天的克隆为准，然后进行筛选时，发现仍然会有很多处理组长成一大片……请问兄台有什么解决办法?
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9楼2018-10-06 10:30:24
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