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真菌原生质体crisper 基因敲除
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| 楼主做了一批原生质体转化子（用crisper体系，潮霉素B是筛选抗性），现在转化子在无抗性的平板上长出来了；但是长得太密集了，现在想从这些转化子里晒出来阳性克隆，请问各位同仁有什么好办法？楼主想到用影印培养法，但是工具（小圆木）不好买而且不知效果。 |
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
渊博震天: 金币+15, MolEPI+1, 鼓励有价值的回帖 2018-11-09 07:37:07
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渊博震天: 金币+15, MolEPI+1, 鼓励有价值的回帖 2018-11-09 07:37:07
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1，首先确定的是，你这个真菌是否基因组或转录组测序验证本身是否存在潮霉素抗性，这个是首先要确定的，如果存在，就不能以这个抗性为做为筛选标记。2，真菌的潮霉素抗性筛选方式，不知道您进行潮霉素梯度筛选时，是接种的一块菌落，还是将菌丝稀释之后用涂布棒涂板，如果是前者，建议在不同潮霉素抗性浓度梯度下，接种同样大小的菌落；如果是后者，建议稀释倍数一样，这样能保证定量。3，真菌不像细菌那样对于抗性的筛选条件稳定，真菌接种到抗性平板上，建议以一个周为筛选周期，观察菌落在不同浓度潮霉素抗性下的生长情况，从而确定最适筛选浓度。（三天太短，后期会陆陆续续长出来假阳性）。4，可否告知一下质粒是什么质粒，因为大部分细菌质粒，都包含细菌的复制子，所以能够稳定遗传复制，而丝状真菌复制子较少，目前我多了解的只有AMA1复制子，是构巢曲霉的复制子，从而保障质粒在丝状真菌中能够稳定传代。由于目前报道的很多文章都没有涉及到复制子的问题，很对文章大部分都是把cas9整合到丝状真菌基因组上才能够保证稳定存在，所以这个方面是一个很关键的因素。因为你的潮霉素基因存在于质粒上，如果该质粒没有真菌复制子，那很有可能传代1次，该质粒就会消失，所以不可能达到质粒稳定遗传的目的，更谈不上敲除了，或者说你的目的是将潮霉素或者cas9整合到基因组上，你要看一下利用的是位点特异性重组还是同源重组。5，真菌的筛选很不稳定，建议不要只考虑潮霉素这一个抗性筛选标记，可选择其他类型的抗性筛选标记，可查阅相关文献。6，刚才你说的这种筛选情况，我觉得应该是400为筛选条件，并进行多伦筛选，才能够筛选到单一突变的菌落。另外，丝状真菌还有一个特殊之处在于，它的菌丝是多核的，即菌丝里面可能包含多个细胞核，即使你幸运敲除成功了几个，还需要多轮筛选才能得到单一的突变体，所以抗性筛选标记和敲除质粒很关键。 发自小木虫Android客户端 |
10楼2018-10-09 09:06:55
7楼2018-10-01 17:12:34
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
渊博震天: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-10-04 19:55:24
渊博震天: 金币+3, 鼓励回帖交流 2018-11-09 09:03:04
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1建议挑取部分菌丝或者是能明显看到的颗粒状真菌，用水适当稀释，再次接种到潮霉素抗性平板筛选（如果条件允许可以适当提高潮霉素抗性浓度），筛选几轮，即可得到单菌落。不知楼主是将潮霉素抗性基因整合到基因组上还是在质粒上的形式存在？ 发自小木虫Android客户端 |
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8楼2018-10-04 16:23:26
送红花一朵|
抗性基因整合在质粒上的。 现在有重新做了一批直接涂在抗性平板上了，在500ug/ml 潮霉素下 没有长出菌落；但是处理组两天内在0-50ug/ml 都长出大量（一片）的单菌落，50-100 ug/ml 有少量单菌落生长出来。现在在筛选这些单菌落…… 但是，这里有个问题，我做的对照组（阴性，不加质粒） 0-70 ug/ml 抗性下，（放置两天）生长量依次降低，80以上就基本不长了，再放置到第五天时80-100的也长出来了。之前，做过100-500的梯度，只有放置超过三天，100-300才会有几个阴性菌落长出来，400以上不生长。所以想问，我应该用什么浓度去筛选阳性克隆？最下抑制浓度是80还是400？ 现在我以80浓度，生长两天的克隆为准，然后进行筛选时，发现仍然会有很多处理组长成一大片……请问兄台有什么解决办法? |
9楼2018-10-06 10:30:24