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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请教这对引物的设计问题
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hbq52

铜虫 (初入文坛)

[交流] 请教这对引物的设计问题

文献中克隆该1230bp长度的基因CDS（5'端和3'端序列见截图）时设计了如下一对引物：
F： 5’-TCA GCA TAT GCC CTT CTC CCG TAC-3’
R：5’-GCA GGA TCC TCG TTC AAT ATA CGG-3’
这对引物中正向引物基本上照抄5'端开始部分序列+酶切位点（下划线部分）+保护碱基，为什么反向引物除去保护碱基+酶切位点（下划线部分）外的部分与3'端的互补序列相差这么大，一般反向引物配对部分不是用3'端的互补序列么（或适当调整部分碱基）？相差大的话能克隆出来吗？

请教这对引物的设计问题
1.png


请教这对引物的设计问题-1
2.png
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1楼2018-09-22 23:16:27
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mxyypo041

禁虫 (小有名气)
★
hbq52(金币+1): 谢谢参与
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2楼2018-09-22 23:56:39
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GRUBBY_WU

铁杆木虫 (著名写手)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
这1230bp的参考序列是cdna还是cds？可以把反向引物反向互补后在参考序列里比对下找位置。正常情侣下正反引物都应该是match的

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22楼2018-09-23 08:29:45
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hbq52

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
22楼: Originally posted by GRUBBY_WU at 2018-09-23 08:29:45
这1230bp的参考序列是cdna还是cds？可以把反向引物反向互补后在参考序列里比对下找位置。正常情侣下正反引物都应该是match的

谢谢兄弟回复。这个序列NCBI上写的是complete cds，是作者在第一篇文献中克隆测序该基因后上传到GenBank的，在他的第二篇文献中设计了这对引物去克隆表达这个基因，5'端的引物是照抄的没问题，然而反向引物我反向互补后与这个CDS比对没有相似性，求指点
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23楼2018-09-23 09:27:13
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GRUBBY_WU

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
23楼: Originally posted by hbq52 at 2018-09-23 09:27:13
谢谢兄弟回复。这个序列NCBI上写的是complete cds，是作者在第一篇文献中克隆测序该基因后上传到GenBank的，在他的第二篇文献中设计了这对引物去克隆表达这个基因，5'端的引物是照抄的没问题，然而反向引物我反向互 ...

可以在ncbi或ucsc上把别人上传的这个基因的cdna和cds找出来看看

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24楼2018-09-23 10:00:03
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apple53

新虫 (初入文坛)
★
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pcr至少15个碱基配对哦

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25楼2018-09-23 11:38:57
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匿名

用户注销 (初入文坛)
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26楼2019-07-01 22:08:02
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zgjut0683楼
2018-09-23 00:12   回复  
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zqvuc0434楼
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dongmings5楼
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kzhk9576楼
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dcjwwd6047楼
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dqmdvmb628楼
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tyeaptd28310楼
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rujbvfv92211楼
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wrrkcxb25712楼
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hhjuvxp9213楼
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kpcgyey9614楼
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kqbhn23415楼
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vtvzajk65716楼
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zhuimeng30517楼
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kutpxg17918楼
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bbgtn46519楼
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o5793393321楼
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