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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白表达问题
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mjl3680

木虫 (小有名气)

[交流] 蛋白表达问题

我是用pet30a+做表达载体，构建的质粒包括了两段要表达的基因，这两段基因前一个就是N端有ATG没有终止密码子，后一个有ATG也有终止密码子，这样构建的质粒转化到大肠杆菌，发现后面一段基因表达了，因为后一段是荧光蛋白，菌诱导后有很强的荧光，不知道是量不够还是什么原因,SDS-PAGE看不出条带，这种情况，是融合表达，还是跳过前面那段基因直接表达后面这段呢？两段外源基因都700bp左右，请知道的兄弟姐妹们指点。
做WB还得费好多事，有没有别的方法检测，电泳都看不到，用NI柱也没分离到，什么原因啊
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1楼 2009-04-08 10:10:59
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mjl3680

木虫 (小有名气)
知道的前辈，给予指点啊，不知道怎么办好了
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5楼2009-04-14 17:46:26
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jasco

木虫 (正式写手)
是不是融和表达要看你两端基因的读框是否一致啦，如果是同一个读框的，那么肯定前面的基因也有表达，只不过可能是表达量低导致page无明显条带
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2楼2009-04-08 10:45:18
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mjl3680

木虫 (小有名气)
后面那个基因肯定正确表达了，因为诱导后有荧光，这能代表是融合表达吗？还是会跳过前面的那段，直接表达后面的呢？
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3楼2009-04-08 17:04:20
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mjl3680

木虫 (小有名气)
继续这个话题，我是用PET30a+作为表达质粒，利用N端的组氨酸标签+我的目的基因（约3k大小，有ATG没有终止密码子）+GFP基因（有ATG也有终止密码子）这样构建的质粒，理论上在融合蛋白N端应该有组氨酸标签，而C端没有，可我最近提高了表达量，而且是可溶的，通过NI柱层析后，可以得到纯化的蛋白，跑SDS-PAGE分子量只是融合蛋白的一半，3K左右，GFP绿色荧光蛋白肯定是有，难道是跳过前面的目的基因了吗？但是怎么还能通过Ni柱纯化得到？可以跳过700个碱基而表达后面的基因吗？希望给予指点，很郁闷啊
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4楼2009-04-14 16:22:38
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