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mjl3680

木虫 (小有名气)

[交流] 蛋白表达问题

我是用pet30a+做表达载体,构建的质粒包括了两段要表达的基因,这两段基因前一个就是N端有ATG没有终止密码子,后一个有ATG也有终止密码子,这样构建的质粒转化到大肠杆菌,发现后面一段基因表达了,因为后一段是荧光蛋白,菌诱导后有很强的荧光,不知道是量不够还是什么原因,SDS-PAGE看不出条带,这种情况,是融合表达,还是跳过前面那段基因直接表达后面这段呢?两段外源基因都700bp左右,请知道的兄弟姐妹们指点。
做WB还得费好多事,有没有别的方法检测,电泳都看不到,用NI柱也没分离到,什么原因啊
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mjl3680

木虫 (小有名气)

知道的前辈,给予指点啊,不知道怎么办好了
5楼2009-04-14 17:46:26
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jasco

木虫 (正式写手)

是不是融和表达要看你两端基因的读框是否一致啦,如果是同一个读框的,那么肯定前面的基因也有表达,只不过可能是表达量低导致page无明显条带
2楼2009-04-08 10:45:18
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mjl3680

木虫 (小有名气)

后面那个基因肯定正确表达了,因为诱导后有荧光,这能代表是融合表达吗?还是会跳过前面的那段,直接表达后面的呢?
3楼2009-04-08 17:04:20
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mjl3680

木虫 (小有名气)

继续这个话题,我是用PET30a+作为表达质粒,利用N端的组氨酸标签+我的目的基因(约3k大小,有ATG没有终止密码子)+GFP基因(有ATG也有终止密码子)这样构建的质粒,理论上在融合蛋白N端应该有组氨酸标签,而C端没有,可我最近提高了表达量,而且是可溶的,通过NI柱层析后,可以得到纯化的蛋白,跑SDS-PAGE分子量只是融合蛋白的一半,3K左右,GFP绿色荧光蛋白肯定是有,难道是跳过前面的目的基因了吗?但是怎么还能通过Ni柱纯化得到?可以跳过700个碱基而表达后面的基因吗?希望给予指点,很郁闷啊
4楼2009-04-14 16:22:38
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