24小时热门版块排行榜    

查看: 504  |  回复: 5
当前主题已经存档。
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

mjl3680

木虫 (小有名气)

[交流] 蛋白表达问题

我是用pet30a+做表达载体,构建的质粒包括了两段要表达的基因,这两段基因前一个就是N端有ATG没有终止密码子,后一个有ATG也有终止密码子,这样构建的质粒转化到大肠杆菌,发现后面一段基因表达了,因为后一段是荧光蛋白,菌诱导后有很强的荧光,不知道是量不够还是什么原因,SDS-PAGE看不出条带,这种情况,是融合表达,还是跳过前面那段基因直接表达后面这段呢?两段外源基因都700bp左右,请知道的兄弟姐妹们指点。
做WB还得费好多事,有没有别的方法检测,电泳都看不到,用NI柱也没分离到,什么原因啊
回复此楼

» 猜你喜欢

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mjl3680

木虫 (小有名气)

后面那个基因肯定正确表达了,因为诱导后有荧光,这能代表是融合表达吗?还是会跳过前面的那段,直接表达后面的呢?
3楼2009-04-08 17:04:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 6 个回答

jasco

木虫 (正式写手)

是不是融和表达要看你两端基因的读框是否一致啦,如果是同一个读框的,那么肯定前面的基因也有表达,只不过可能是表达量低导致page无明显条带
2楼2009-04-08 10:45:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mjl3680

木虫 (小有名气)

继续这个话题,我是用PET30a+作为表达质粒,利用N端的组氨酸标签+我的目的基因(约3k大小,有ATG没有终止密码子)+GFP基因(有ATG也有终止密码子)这样构建的质粒,理论上在融合蛋白N端应该有组氨酸标签,而C端没有,可我最近提高了表达量,而且是可溶的,通过NI柱层析后,可以得到纯化的蛋白,跑SDS-PAGE分子量只是融合蛋白的一半,3K左右,GFP绿色荧光蛋白肯定是有,难道是跳过前面的目的基因了吗?但是怎么还能通过Ni柱纯化得到?可以跳过700个碱基而表达后面的基因吗?希望给予指点,很郁闷啊
4楼2009-04-14 16:22:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mjl3680

木虫 (小有名气)

知道的前辈,给予指点啊,不知道怎么办好了
5楼2009-04-14 17:46:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 312求调剂 +5 上岸吧ZJY 2026-03-22 7/350 2026-03-25 22:20 by 544594351
[考研] 0854AI CV方向招收调剂 +4 章小鱼567 2026-03-23 4/200 2026-03-25 17:04 by CoderLoser
[考研] 材料学硕333求调剂 +4 北道巷 2026-03-24 4/200 2026-03-25 14:16 by mapenggao
[考研] 材料与化工考研调剂 +9 孅華 2026-03-22 9/450 2026-03-25 13:09 by cmz0325
[考研] 081700 调剂 267分 +10 迷人的哈哈 2026-03-23 10/500 2026-03-25 12:12 by userper
[考研] 化学调剂 +6 yzysaa 2026-03-21 6/300 2026-03-25 09:27 by aa331100
[考研] 318求调剂 +5 plum李子 2026-03-21 8/400 2026-03-25 09:26 by aa331100
[考研] 材料学求调剂 +6 Stella_Yao 2026-03-20 6/300 2026-03-25 00:37 by baoball
[考研] 求调剂 +6 研研,接电话 2026-03-24 7/350 2026-03-24 17:01 by barlinike
[考研] 材料考研调剂生 +3 黄粱一梦千年 2026-03-24 3/150 2026-03-24 17:00 by barlinike
[考研] 080500求调剂 +3 zzzzfan 2026-03-24 3/150 2026-03-24 16:38 by barlinike
[考研] 291求调剂 +3 HanBeiNingZC 2026-03-24 3/150 2026-03-24 16:34 by barlinike
[考研] 300求调剂,材料科学英一数二 +5 leaflight 2026-03-24 5/250 2026-03-24 16:25 by laoshidan
[考研] 材料专硕331求调剂 +4 鲜当牛 2026-03-24 4/200 2026-03-24 15:58 by JourneyLucky
[考研] 336求调剂 +4 收到VS 2026-03-20 4/200 2026-03-23 19:02 by macy2011
[考研] 求调剂一志愿海大,0703化学学硕304分,有大创项目,四级已过 +6 幸运哩哩 2026-03-22 10/500 2026-03-22 20:10 by edmund7
[考研] 材料与化工(0856)304求B区调剂 +3 邱gl 2026-03-20 7/350 2026-03-21 19:05 by 15709483992
[考研] 297求调剂 +3 喜欢还是不甘心 2026-03-20 3/150 2026-03-21 18:33 by 学员8dgXkO
[考研] 336求调剂 +5 rmc8866 2026-03-21 5/250 2026-03-21 17:24 by 学员8dgXkO
[考研] 317求调剂 +5 申子申申 2026-03-19 9/450 2026-03-20 22:26 by JourneyLucky
信息提示
请填处理意见