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关于基因转移获取目的基因的相关实验 已有1人参与
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小弟有关于基因连接质粒的问题想请教各位老师 我的实验的大体流程是这样的，想进行质粒转染到目的肿瘤细胞，使希望的基因获得高表达。质粒为pFLAG-CMV-6a，并已经设计好了需扩增基因的引物序列和酶切位点，但是使用以前之前有的cDNA文库进行目的基因扩增，然后琼脂糖电泳并未跑出目的条带，所以想采用别的cDNA序列进行扩增。 因为我目前没有其他的cDNA文库，不知道我以下想法可行吗， 1）收集同种肿瘤细胞，提取总RNA 2）采用随机6引物，以总RNA为模板用Superscript III的试剂盒进行逆转录成第一链cDNA 3）以第一链cDNA为模板，利用已经合成的引物进行PCR，然后进行琼脂糖电泳，查看能否扩增出需要的目的基因 4）如有扩增出目的基因，然后进行后续的质粒连接反应等一系列实验 请教各位老师，不知道我的这种想法可行吗 |
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2楼2018-09-19 10:38:04
3楼2018-09-19 17:15:29
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4楼2018-09-20 11:07:57
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各位老师，后来我逆转录的cDNA做了一遍PCR，选择了两个退火温度，一个是55度，一个是52度。同时为了检测转录cDNA是否问题，同时扩增b-actin 最左边第一泳道是DNA marker 1kb，最下面的一条是500bp的位置，目的基金是596bp 第二泳道是细胞不加刺激剂的cDNA，退火温度 55度，扩增目的基因 第三泳道是细胞加刺激剂的cDNA，退火温度 55度，扩增目的基因 第四泳道是细胞不加刺激剂的cDNA，退火温度55度，扩增b-actin，检验是否成功由总RNA逆转录为cDNA 第五泳道是细胞加刺激剂的cDNA，退火温度55度，扩增b-actin，检验是否成功由总RNA逆转录为cDNA 第六泳道是细胞不加刺激剂的cDNA，退火温度 52度，扩增目的基因 第七泳道是细胞加刺激剂的cDNA，退火温度 52度，扩增目的基因 第八泳道是细胞不加刺激剂的cDNA，退火温度52度，扩增b-actin，检验是否成功由总RNA逆转录为cDNA 第九泳道是细胞加刺激剂的cDNA，退火温度52度，扩增b-actin，检验是否成功由总RNA逆转录为cDNA 第一泳道的条带基本是590多bp，可以显示是目的基因。 今天为了重复一遍这个PCR扩增条件，同样的条件及反应体系，今天的PCR扩增后连一点条带都没有，请问这有可能是什么原因，为什么有时能扩增出来，有时就扩增不出来 |
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2018-09-25 16:02:13, 76 K
5楼2018-09-25 16:04:41