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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于基因转移获取目的基因的相关实验
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v2zs

新虫 (小有名气)

[求助] 关于基因转移获取目的基因的相关实验 已有1人参与

小弟有关于基因连接质粒的问题想请教各位老师

我的实验的大体流程是这样的，想进行质粒转染到目的肿瘤细胞，使希望的基因获得高表达。质粒为pFLAG-CMV-6a，并已经设计好了需扩增基因的引物序列和酶切位点，但是使用以前之前有的cDNA文库进行目的基因扩增，然后琼脂糖电泳并未跑出目的条带，所以想采用别的cDNA序列进行扩增。

因为我目前没有其他的cDNA文库，不知道我以下想法可行吗，

1）收集同种肿瘤细胞，提取总RNA

2）采用随机6引物，以总RNA为模板用Superscript III的试剂盒进行逆转录成第一链cDNA

3）以第一链cDNA为模板，利用已经合成的引物进行PCR，然后进行琼脂糖电泳，查看能否扩增出需要的目的基因

4）如有扩增出目的基因，然后进行后续的质粒连接反应等一系列实验


请教各位老师，不知道我的这种想法可行吗
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1楼 2018-09-17 22:50:02
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Marc-Zhong

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
理论上我觉得可以操作，但是可以试下优化下。
1. 你确定你的肿瘤细胞里目的基因是有表达，或者尝试找另外来源高表达的细胞/组织
2. 我觉得也可以用特异引物做反转录
3. 也可以尝试自己合成cDNA
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2楼2018-09-19 10:38:04
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v2zs

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Marc-Zhong at 2018-09-19 10:38:04
理论上我觉得可以操作，但是可以试下优化下。
1. 你确定你的肿瘤细胞里目的基因是有表达，或者尝试找另外来源高表达的细胞/组织
2. 我觉得也可以用特异引物做反转录
3. 也可以尝试自己合成cDNA

1.特异性引物做反转录
2.随机引物做反转录，然后特异性引物做PCR

这两个有什么区别吗
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3楼2018-09-19 17:15:29
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Marc-Zhong

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by v2zs at 2018-09-19 17:15:29
1.特异性引物做反转录
2.随机引物做反转录，然后特异性引物做PCR

这两个有什么区别吗...

用特异性引物做反转录，会直接得到你后续实验的模板，但是可能很难反转录或者不成功；我个人建议是先用特异引物反转录试下，如果不行就改用随机引物。
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4楼2018-09-20 11:07:57
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v2zs

新虫 (小有名气)
各位老师，后来我逆转录的cDNA做了一遍PCR，选择了两个退火温度，一个是55度，一个是52度。同时为了检测转录cDNA是否问题，同时扩增b-actin

最左边第一泳道是DNA marker 1kb，最下面的一条是500bp的位置，目的基金是596bp

第二泳道是细胞不加刺激剂的cDNA，退火温度 55度，扩增目的基因

第三泳道是细胞加刺激剂的cDNA，退火温度 55度，扩增目的基因

第四泳道是细胞不加刺激剂的cDNA，退火温度55度，扩增b-actin，检验是否成功由总RNA逆转录为cDNA

第五泳道是细胞加刺激剂的cDNA，退火温度55度，扩增b-actin，检验是否成功由总RNA逆转录为cDNA

第六泳道是细胞不加刺激剂的cDNA，退火温度 52度，扩增目的基因

第七泳道是细胞加刺激剂的cDNA，退火温度 52度，扩增目的基因

第八泳道是细胞不加刺激剂的cDNA，退火温度52度，扩增b-actin，检验是否成功由总RNA逆转录为cDNA

第九泳道是细胞加刺激剂的cDNA，退火温度52度，扩增b-actin，检验是否成功由总RNA逆转录为cDNA

第一泳道的条带基本是590多bp，可以显示是目的基因。



今天为了重复一遍这个PCR扩增条件，同样的条件及反应体系，今天的PCR扩增后连一点条带都没有，请问这有可能是什么原因，为什么有时能扩增出来，有时就扩增不出来
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