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小汰宝金虫 (正式写手)
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[求助]
易错PCR的问题...2400bp的基因用taq酶总是P不出来已有1人参与
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求助各位前辈： 我现在想给一段2400bp的基因片段做易错PCR，在不易错的情况下，用PFU或者擎科的mix green(goldstar酶?)都能P出来，但是用Taq和Fast Taq都P不出来，有很多杂条带，没有目标条带，摸了不同退火温度都不行。那直接做易错吧，加了镁离子锰离子，还是P不出来。 但是酶没有问题，实验室其他人用这个酶，无论做不做易错，P他们的小于1000的片段都能P出来。 但是PFU和mix green保真性太高，不考虑用PFU和mix green做随机突变。 问题一： 对于Taq酶来说，2400bp的片段是否太大了所以P不出来？ 基于上面的问题，我就想重新设计，把我的基因分成2段做易错PCR, 因为我的酶是一个氧化还原区域和一个电子传递区域组成的，我就分开来做易错，做两个1200bp的PCR. （还没尝试，不知道能不能P的出来） 但是分开做的话，并没有合适的酶切位点可以选择， 所以如果能P出来，就要用同源连接的方法了。 问题二：可是又听说Taq酶P完之后会加个A，那这样的话，会影响同源连接嘛？是需要引物的设计时，要故意漏一个A在外侧嘛？ 问题三：我就是想给我这个2400bp的片段做随机突变...还有什么其他可采取的方案嘛 |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
渊博震天: 金币+2, 鼓励回帖交流 2018-10-24 10:28:40
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1. 有可能太大。不过除了green taq还有其他的red taq，与其搞成两段，不如都试试。 2. 是有A overhang. 在引物设计上做文章效果不好。不过如果你P全长，好像没有关系吧。取决你具体的克隆细节了。为什么不把引物设计到基因外边？比如，先把WT放质粒上，引物放酶切位点外。虽然更长点，但如果有好的引物，说不定一并解决问题一。 3. 方法太多了。比如，你可以先合成RNA，再反转录，RT的错误率更高。poison PCR的方法就太多了 |
2楼2018-09-12 09:59:25
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渊博震天: 金币+2, 鼓励回帖交流 2018-10-24 10:28:27
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问题一，普通taq扩增4k以内没有太大问题，不知道你2400bp是在克隆载体还是在基因组上，质量良好的模板没有问题的。按你描述pfu，擎科green mix可以，也许你要分析一下序列gc含量以及引物设计。第二个问题，taq会3端加A，解决方法可以将pcr产物用高保真酶mix或单酶配成pcr体系温浴，切掉3端A。第三个问题，如果此实验十分重要，经费充足，可以买安捷伦的随机突变试剂盒Genemorph II 发自小木虫Android客户端 |
3楼2018-09-12 23:03:42