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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 构crispr载体时cas9序列后几百bp错配缺失？
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萌萌君612

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1楼 2018-09-11 14:33:01
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匿名

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2楼2018-09-11 14:50:53
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drwhoknowss

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没有遇到过，不过sanger测序有时会有一段序列质量不好，特别是GCrich的地方。还有就是你验证一下在放入20bp前没问题？
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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
3楼2018-09-12 10:27:21
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drwhoknowss

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2楼: Originally posted by pf790352975 at 2018-09-11 08:50:53
楼主用的哪款crispr敲除载体呢  ，我目前用PX458  转染293T 转染效率不高,  GFP亮度也不强 不知道咋回事  ? 转染PEGFP效率90多 荧光也很强

PX458 GFP亮度不强是正常现象，2A的原因，亮度不够不代表效率不好。你FACS一下，有时发现效率挺高，比如70%
不过更推荐puro那一款
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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
4楼2018-09-12 10:29:21
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萌萌君612

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5楼2018-09-12 14:10:57
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萌萌君612

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6楼2018-09-12 19:22:44
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drwhoknowss

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6楼: Originally posted by 萌萌君612 at 2018-09-12 13:22:44
你好，想再问一下，请公司测通后得到的第二段序列和cas9序列后半段一致（纠正了第一次测序的错配），且和第一次测序有部分重叠，是否可以认为质粒包含有正确的cas9序列呢？...

感觉没问题，应该是正确的。
但我没有亲眼看到峰图，所以只能言尽于此。
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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
7楼2018-09-13 02:35:15
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