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cheng0302

新虫 (初入文坛)

[求助] Takara in-fusion kit 连接后,测序序列总对不上,求大神指点! 已有2人参与

通过PCR获得直线型质粒与目的基因
使用takara in-fusion cloning kit
将三个目的基因分别与直线型表达载体通过同源重组连接
连接后,提取质粒测序
测序结果跟原始序列总是对不上
总是对不上
总是对不上
目前,其中两个目的基因已成功连接上并测序正确,
但是,还有一个,我都测了30个了,都不正确
在这样下去,如何交代
求大神指点
求大神指点
求大神指点
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macgray11

禁虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
渊博震天: 金币+5, 鼓励回帖交流 2018-09-04 07:33:45
本帖内容被屏蔽

2楼2018-09-03 10:33:02
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
连接前,对那个没有连上的基因的PCR产物先做个测序,看看序列对不对;如果把PCR产生的线性化的质粒骨架也去测序一下就更好。
两者无误的话再做连接,可靠性高点。

如果实在不行,重新设计一下引物好了。以前类似的实验也是连接不好,重新换一下引物就搞定了。
3楼2018-09-05 01:26:32
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jasco

木虫 (正式写手)

如果你做的三个基因是平行实验,那么基本可以排除载体和连接体系方面的问题,可以从目的基因着手:
可从两个方向考虑:
1. 目的基因pcr产物,有电泳过么?条带单一么?大小正确么?模板有确认过么?
2. 测序结果,错在哪儿?是长度不对?片段丢失?突变多?
4楼2018-09-05 16:07:06
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毓秀清心

新虫 (初入文坛)

我也遇到了同样的情况,您解决了吗?
5楼2022-06-21 19:57:16
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