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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Takara in-fusion kit 连接后，测序序列总对不上，求大神指点！
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cheng0302

新虫 (初入文坛)

[求助] Takara in-fusion kit 连接后，测序序列总对不上，求大神指点！ 已有2人参与

通过PCR获得直线型质粒与目的基因
使用takara in-fusion cloning kit
将三个目的基因分别与直线型表达载体通过同源重组连接
连接后，提取质粒测序
测序结果跟原始序列总是对不上
总是对不上
总是对不上
目前，其中两个目的基因已成功连接上并测序正确，
但是，还有一个，我都测了30个了，都不正确
在这样下去，如何交代
求大神指点
求大神指点
求大神指点
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1楼 2018-09-03 09:33:49
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macgray11

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
渊博震天: 金币+5, 鼓励回帖交流 2018-09-04 07:33:45
本帖内容被屏蔽
2楼2018-09-03 10:33:02
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
连接前，对那个没有连上的基因的PCR产物先做个测序，看看序列对不对；如果把PCR产生的线性化的质粒骨架也去测序一下就更好。
两者无误的话再做连接，可靠性高点。

如果实在不行，重新设计一下引物好了。以前类似的实验也是连接不好，重新换一下引物就搞定了。
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3楼2018-09-05 01:26:32
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jasco

木虫 (正式写手)
如果你做的三个基因是平行实验，那么基本可以排除载体和连接体系方面的问题，可以从目的基因着手：
可从两个方向考虑：
1. 目的基因pcr产物，有电泳过么？条带单一么？大小正确么？模板有确认过么？
2. 测序结果，错在哪儿？是长度不对？片段丢失？突变多？
赞一下 回复此楼
4楼2018-09-05 16:07:06
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毓秀清心

新虫 (初入文坛)
我也遇到了同样的情况，您解决了吗？
赞一下 回复此楼
5楼2022-06-21 19:57:16
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