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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 菌液PCR验证
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芥末本绿

金虫 (正式写手)

[交流] 菌液PCR验证 已有6人参与

转化实验后，挑取平板上的转化子摇菌，。收集菌体，无菌去离子水重悬，沸水浴作为模板进行菌液PCR验证。
PCR产物分别在目的大小和100bp处产生明显的条带，且100bp的条带更亮。为什么会出现这个条带？
最初PCR获得目的基因的过程中使用的相同的引物，并未出现这个条带。可初步排除引物二聚体

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1楼 2018-08-02 20:52:51
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
稍微提高一下退火温度试试

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2楼2018-08-02 21:18:32
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芥末本绿

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-08-02 21:18:32
稍微提高一下退火温度试试

除了反应体系从50ul降到了20ul，其他的条件都没有改变，和之前做的PCR是一样的

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3楼2018-08-02 21:59:16
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chenpp2006

新虫 (正式写手)
可能不是单克隆。多挑几个试试

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4楼2018-08-03 03:22:52
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芥末本绿

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by chenpp2006 at 2018-08-03 03:22:52
可能不是单克隆。多挑几个试试

挑了三个都是这样的，那个板上就长了三个

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5楼2018-08-03 07:56:56
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

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5楼: Originally posted by 芥末本绿 at 2018-08-03 07:56:56
挑了三个都是这样的，那个板上就长了三个
...

这三个在预期大小附近有条带吗？如果有的话可以送去测个序看看是否是非特异性扩增
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6楼2018-08-03 09:15:15
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雨儿天0320

铜虫 (正式写手)
★
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不知道你的菌液PCR用的是什么酶？建议用最普通，直白点就是低级一点的酶（TaKaRa的 r taq），这样试试。我之前遇到过这样的问题，换了酶就可以了
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7楼2018-08-03 11:16:42
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ghst110

银虫 (正式写手)
★
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降低引物浓度，提高退火温度。不过要说的一点，菌落pcr本身就不是特别精准，最好还是加上提取质粒验证或pcr产物测序验证

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*才随遇长，识以穷精*
8楼2018-08-03 13:44:54
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840792553

金虫 (正式写手)
感觉菌液不靠谱

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我就是很牛逼！
9楼2018-08-03 16:38:11
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芥末本绿

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-08-03 09:15:15
这三个在预期大小附近有条带吗？如果有的话可以送去测个序看看是否是非特异性扩增...

在预期大小有，但是亮度比一般情况的要弱，送去测序说测序结果差
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10楼2018-08-08 09:34:52
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