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最近在做的一个重组质粒的实验流程，想请大家帮我分析一下问题出在哪里
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| 我是按照一篇论文的大概步骤来操作的，构建的重组质粒用于同源重组。先分别从一段DNA上扩增出两个片段（1和2，分别为880bp和770bp），然后从一个质粒上扩增出一段抗性基因（3，为1000bp），接着将1和2分别连接T载体（平末端连接），酶切回收，再与酶切过的pGEX相连，然后单酶切将3插入1和2的中间。现在的问题是，片段1酶切出来了，PCR也对，但是片段2并连不上T载体。因为1和2两个片段大小也差不多，进行的操作也是一样的，所以做了很多其他实验来找问题，但还是没有找到根本的问题。另外用的T载体过期了不知道有没有影响，因为片段1能做出来所以我觉得应该还能用。还做过一次直接将片段酶切然后过柱，与载体连接，提取的质粒做PCR，片段1有条带片段2没有，酶切的话就只有载体大小的一条片段，送去测序则是说有特殊结构。想问一下大家接下去应该做些什么 |
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wuhu0612331
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