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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » pcr结果不稳定
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Sarah23333

新虫 (著名写手)

[求助] pcr结果不稳定 已有2人参与

本人最近在用pcr筛选特定基因阳性株，用到的是大肠杆菌，煮沸法提取的DNA。第一次P出了很多阳性，后面针对这些阳性株再进行同样的pcr，就再也P不出来条带了，而且阳性株经常P不出条带，我想知道是哪个环节错了，是DNA提取的问题吗？我的操作…我始终觉得不可能会有这么大的失误，有没有哪位大神知道，指导指导哇

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1楼 2018-05-27 22:11:25
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sketskys

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
snoopytbw: 金币+3, 鼓励 2018-05-29 07:19:42
有时候可能是煮沸法的问题 菌的浓度太高反而煮沸不好裂解出DNA 可以试下其他方法提DNA然后再PCR呢？

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2楼2018-05-27 22:25:44
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Sarah23333

新虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sketskys at 2018-05-27 22:25:44
有时候可能是煮沸法的问题 菌的浓度太高反而煮沸不好裂解出DNA 可以试下其他方法提DNA然后再PCR呢？

谢谢亲

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3楼2018-05-27 22:52:57
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ghst110

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小冀-: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-05-29 15:56:00
使用NaOH 20mM来煮沸裂解。或者选一个专用于菌P的mix吧。
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*才随遇长，识以穷精*
4楼2018-05-28 10:04:01
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Sarah23333

新虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ghst110 at 2018-05-28 10:04:01
使用NaOH 20mM来煮沸裂解。或者选一个专用于菌P的mix吧。

真的会是DNA提取的问题吗？第一次阳性，后面阴性

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5楼2018-05-28 16:38:01
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二十一业

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
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5楼: Originally posted by Sarah23333 at 2018-05-28 16:38:01
真的会是DNA提取的问题吗？第一次阳性，后面阴性
...

我想到一个别的可能性，你的目的基因是在质粒上的，传代培养后，质粒丢失导致后面阴性了
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6楼2018-05-28 17:14:45
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Sarah23333

新虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 二十一业 at 2018-05-28 17:14:45
我想到一个别的可能性，你的目的基因是在质粒上的，传代培养后，质粒丢失导致后面阴性了...

但是我用的是同一次提取的DNA…

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7楼2018-05-28 17:34:48
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二十一业

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by Sarah23333 at 2018-05-28 17:34:48
但是我用的是同一次提取的DNA…
...

跑个胶看看还有没有DNA了……
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Sarah23333
8楼2018-05-28 18:00:24
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Sarah23333

新虫 (著名写手)
送红花一朵
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8楼: Originally posted by 二十一业 at 2018-05-28 18:00:24
跑个胶看看还有没有DNA了……...

是那种简单的琼脂糖凝胶电泳吗？直接混合loading加DNA吗

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9楼2018-05-28 18:35:11
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ghst110

银虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by Sarah23333 at 2018-05-28 18:35:11
是那种简单的琼脂糖凝胶电泳吗？直接混合loading加DNA吗
...

菌液裂解的跑胶也看不到总DNA条带吧，楼主你是没有用试剂盒提取基因组，而是简单的裂解后作模板扩增鉴定的，这不就是菌P吗。菌落PCR太简单了。一般的酶都可以做。可能你保存的模板（裂解的）已经降解了，导致第二次P不出。如果菌还有的的话，重新制备一下再PCR吧
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*才随遇长，识以穷精*
10楼2018-05-29 09:34:55
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