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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 链霉菌接合转移求助
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kakashi冠

铁虫 (初入文坛)

[求助] 链霉菌接合转移求助 已有3人参与

目前在做链霉菌基因敲除，接合转移这一步做了三个多月还是没见转化子生长，质粒是根据PKC1139改造的，按照经典的接合转移方法做的，对共受体数量，热激温度，铺药时间都做了梯度实验，还是没见转化子，请各位大侠帮忙分析其中可能的原因？另外，铺药浓度是按照1ml水包括50 μｇ／ｍＬ的安普霉素和50 μｇ／ｍＬ的萘啶酮酸？还是根据培养基体积（约20毫升）1ml水包含1000 μｇ／ｍＬ的安普霉素和1000 μｇ／ｍＬ的萘啶酮酸？
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1楼 2018-05-25 14:38:58
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In_vain

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
snoopytbw: 金币+2, 鼓励交流 2018-08-05 11:16:16
你做接合转移用的供体菌是ETU还是S17？另外你有筛选你的链霉菌在哪种培养基上产孢最好吗？覆盖我用的是浓度是按照1ml水包括50 μｇ／ｍＬ的安普霉素和50 μｇ／ｍＬ的萘啶酮酸这样来的，可以长出接合子。但是我的问题的接合子纯化的时候涂在apr平板上不长，无法得到纯化的接合子，你有遇到这种情况吗？
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2楼2018-06-11 11:07:34
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麻雷子

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by In_vain at 2018-06-11 11:07:34
你做接合转移用的供体菌是ETU还是S17？另外你有筛选你的链霉菌在哪种培养基上产孢最好吗？覆盖我用的是浓度是按照1ml水包括50 μｇ／ｍＬ的安普霉素和50 μｇ／ｍＬ的萘啶酮酸这样来的，可以长出接合子。但是我的问 ...

你解决了嘛，我接合转移之后一直不长，不知道什么原因

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3楼2018-08-05 11:08:52
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xzx018

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
snoopytbw: 金币+3, 热心应助，鼓励 2018-08-14 16:34:00
也有可能是pkc1139的复制子在你那个菌里不适用。你换些复制子或者换pset152这种整合型的质粒先试试
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4楼2018-08-06 09:55:38
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飞鸟与冬天

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by kakashi冠 at 2018-08-10 20:39:16
现在长出来了，可能是预萌发以前没有做好。现在在倒持筛选了

楼主，请问一下你是怎么优化的，我也是用pKC1139,做了快一个月，平板上什么都不长。我的链霉菌是耐热的，50度热激10min后预萌发两小时的。
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7楼2018-08-14 11:06:27
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young1983

木虫 (正式写手)
我实验室可帮忙开展接合转移实验

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9楼2019-08-21 23:54:32
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普通回帖

kakashi冠

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by In_vain at 2018-06-11 11:07:34
你做接合转移用的供体菌是ETU还是S17？另外你有筛选你的链霉菌在哪种培养基上产孢最好吗？覆盖我用的是浓度是按照1ml水包括50 μｇ／ｍＬ的安普霉素和50 μｇ／ｍＬ的萘啶酮酸这样来的，可以长出接合子。但是我的问 ...

你这个铺药的浓度太低了吧，长出来的不一定是结合子
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5楼2018-08-10 20:37:25
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kakashi冠

铁虫 (初入文坛)
现在长出来了，可能是预萌发以前没有做好。现在在倒持筛选了
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6楼2018-08-10 20:39:16
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hd305

新虫 (初入文坛)
我用的也是基于PKC构建的敲除质粒，然后做了一个多月接合转移也一直没长出接合子，请问楼主是修改了哪些关键步骤长出来的接合子，能交流一下嘛，我纯属新手们实验室也没人做，完全自己摸索，感觉没头绪..
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8楼2019-06-05 09:45:28
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八丫头

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 飞鸟与冬天 at 2018-08-14 11:06:27
楼主，请问一下你是怎么优化的，我也是用pKC1139,做了快一个月，平板上什么都不长。我的链霉菌是耐热的，50度热激10min后预萌发两小时的。...

请问你预萌发是37°还是28°
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10楼2020-05-19 10:46:21
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