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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 关于CRISPR Cas9同源重组敲除基因验证p出来两条带
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无金易主

新虫 (小有名气)

[交流] 关于CRISPR Cas9同源重组敲除基因验证p出来两条带

关于CRISPR Cas9同源重组敲除大肠杆菌BL21基因验证p出来两条带，一条野生型大小条带，一条同源臂大小条带，请问大家做Red同源重组敲除或者crispr类似敲除基因的时候遇见过这个情况吗？你们都是怎么解决的呢，求好人指点

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1楼 2018-05-19 23:13:01
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-05-21 07:57:23
估计就是重组和未重组混杂一起了
那就筛克隆好了，用单克隆一个个来做PCR鉴定，肯定能够挑出来
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2楼2018-05-20 03:03:09
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无金易主

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by soarrow at 2018-05-20 03:03:09
估计就是重组和未重组混杂一起了
那就筛克隆好了，用单克隆一个个来做PCR鉴定，肯定能够挑出来

挑的单菌落，确定没杂菌

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3楼2018-05-20 22:25:07
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
那就奇怪了。重组片段你是用质粒还是线性DNA？
如果是质粒的话，有没有可能是没有发生重组，而质粒存在于菌体，所以扩增时候有两条带！？
可以考虑换对引物，用比同源臂上下游范围更大一点的位置，确认有没有真正重组发生。
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4楼2018-05-22 01:11:21
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无金易主

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by soarrow at 2018-05-22 01:11:21
那就奇怪了。重组片段你是用质粒还是线性DNA？
如果是质粒的话，有没有可能是没有发生重组，而质粒存在于菌体，所以扩增时候有两条带！？
可以考虑换对引物，用比同源臂上下游范围更大一点的位置，确认有没有真正 ...

线形DNA，已经打算重新电转了

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5楼2018-05-25 00:24:49
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by 无金易主 at 2018-05-25 00:24:49
线形DNA，已经打算重新电转了
...

也好，相当于实验的重复验证
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6楼2018-05-25 03:22:47
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FYH2015

捐助贵宾 (初入文坛)
★
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哥们 敲得咋样了？貌似BL21比K12什么的难敲呀
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7楼2020-05-18 19:11:33
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HK驱魔者

铁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
修复模板浓度太高，挑菌的时候沾到了

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8楼2020-11-21 16:44:20
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xiatingxue

木虫 (正式写手)
★
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兄弟，请问这个问题怎么解决了，谢谢
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骐骥一跃，不能十步;驽马十驾，功在不舍
9楼2022-07-08 22:03:25
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