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木虫 (职业作家)

模板稀释的不好,引物应该没问题,再检查下缓冲液和跑电泳的时间
11楼2009-03-25 00:13:17
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cauzhangtao

木虫 (正式写手)

没有扩出来
建议你把你的基因序列列出来
看看是不是引物不合适
12楼2009-03-25 00:30:19
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sutao1979

木虫 (著名写手)

小木虫10年groupleader

★ ★
lwf991229(金币+2,VIP+0):3Q~ 3-26 15:17
个人认为模板降解的可能性比较大,因为二次pcr是用pcr产物做模板的,pcr产物本身就不稳定,所以再次pcr的时候特别容易出现弥散带,可以用一种高保真的taq酶试试看,另外,如果是模板浓度有问题的话,你可以做一个梯度稀释,一般浓度高容易出现弥散;顺便说一下,第一副电泳图的产物浓度太低了,条带很不清晰(原因很多,引物错配,模板不纯都有可能),用这样的模板很难进行二次pcr的,所以,还是先优化一下第一次pcr,再继续往下做。
会当凌绝顶,一览众山小
13楼2009-03-25 05:16:25
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jiwu20

铜虫 (小有名气)


lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~3Q~ 3-26 15:18
图片中marker右面是二次PCR产物跑的琼脂糖。
二次PCR产物做模板,浓度太高,要稀释至少100倍,稀释以下再试。
14楼2009-03-25 07:56:47
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zhouquan7175

金虫 (小有名气)


污染了!模板被降解。模板反复冻融也会出现这种情况!
15楼2009-03-25 15:31:19
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wangtengxu

木虫 (正式写手)

1.你的第一步PCR显然不行,条带那么弱,是不能做二次PCR的模板的
2.首先重新优化PCR体系,要扩出清晰的带
1)增加模板量(是CDNA吗?)
2)增加循环数
3)试试降低退火温度

关注中
想和有趣的人一起做有趣的事。
16楼2009-03-25 19:01:48
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jqq1985

银虫 (正式写手)

本人出现同样问题,盼解答
17楼2009-03-25 20:09:35
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xia710516

金虫 (正式写手)

检查一下反应体系吧,16srna是多拷贝的,根本不用二次PCR。
18楼2009-03-25 22:45:27
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357277005

金虫 (正式写手)

第一个图你是不是应该重新仔细做一遍,是不是忘加了什么,或是污染了。第二个图有点意思了,应该再优化一下条件比如加点离子如镁离子之类的。可以借本书看看
豆豆,可爱的豆豆!
19楼2009-03-25 22:46:22
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xuyh3000

铁虫 (初入文坛)


lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~ 3-26 15:18
二次PCR模板可能就是没有稀释,污染多,特异性很差,建议摸索你本身的退火温度,或做个降落PCR,增加亮度选做二次PCR并不是什么好的选择。
20楼2009-03-26 10:31:02
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