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异源表达总是得不到活性蛋白 是这段基因没有做下去的必要了吗 已有2人参与
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| 请问 真核微生物里的一段产酶基因做异源表达，有可能真核原核都得不到活性蛋白吗？ |
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用户晓晓
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【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
渊博震天: 金币+3, 鼓励有价值的回帖 2018-07-12 16:34:41
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首先答案肯定是否定的！ 异源表达要得到具有活性的蛋白，影响条件还是很多的： 1，蛋白表达的氨基酸序列的准确性，跟你使用的载体或者物种有关，是否需要进行氨基酸密码子优化，有事也是很重要的事情。 2，即便是表达了完整的蛋白，蛋白是否能够正确的折叠组装同样是很重要的。 3，一些表观修饰，比如磷酸化，泛素化，乙酰化 可能是异源表达难以模拟的。 4，有些蛋白需要有辅助蛋白的作用，才能发挥功能。 这些都可能导致异源表达的蛋白没有酶活，不代表这个基因不重要。 祝试验顺利！ |
2楼2018-05-16 15:21:20
3楼2018-05-16 17:17:38
4楼2018-05-21 08:19:26
【答案】应助回帖
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渊博震天: 金币+3, 鼓励有价值的回帖 2018-07-12 16:35:45
渊博震天: 金币+3, 鼓励有价值的回帖 2018-07-12 16:35:45
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从你叙述看，目前主要问题是在表达上 原核表达的话，都在包涵体，不溶，你的蛋白多大呢？低温诱导、高或低水平OD值以及低浓度IPTG都试过吗？换Rosseta的话一般不会促溶，这个菌株可以提高表达水平。如果你还想做原核，可以试TransB的菌株，我用过全式金的，有助于形成二硫键，对于含二硫键的蛋白有促溶效果，促折叠 原核表达如果愿意再花些精力，还可以尝试与分子伴侣体系共表达，有多种不同的分子伴侣可以选择，这个体系Takara有卖，你可以去官网看一下说明书，再决定 促折叠的话，标签也很重要，你用的全是pET系列的，可以尝试GST或者MBP标签，这两种标签分子量大，但是可以促进折叠，促溶，另外对于MBP标签，还可以选用pMAL-p5x载体，蛋白会被分泌到周质空间，也是为了促进蛋白折叠 如果都不行，可以考虑对蛋白进行分段表达，不清楚你下游是用来做什么，这个酶有多大，结构是否清楚，可以尝试只表达酶活区域，分子小了，会更易于表达 再不济，如果你愿意，可以尝试变性复性，这个一般难度都比较大，条件摸索起来很费劲，不建议，但也是一种方法 酵母表达的话，一般用的都是营养缺陷型的筛选标记吧，一般不容易染菌，但是你的有时有，有时没有的，只能自己多检查自己的体系和方法了，是用诱导型的吗？有些情况下也要考虑是否你的外源蛋白对宿主细胞有毒性，当然，肯定要避免杂菌污染，这个没法分析 如果这些表达体系经过严格操作验证无法获得正确的酶，只能考虑比如哺乳动物表达体系，293，或者昆虫细胞一类的表达体系，我用昆虫-杆状病毒的表达体系，如果有问题，可以再讨论 你的酶是哪种类型？测定酶活的方法以及底物选择都正确吗？这些也要保证无问题 发自小木虫Android客户端 |
5楼2018-05-22 16:09:41
6楼2018-07-12 13:22:49