| 查看: 2171 | 回复: 4 | |||
[交流]
Sal1和sac2双酶切构建表达载体 已有2人参与
|
|
载体用的是pDG160质粒，进行sal1和sac2双酶切3.5小时,连接的片段经PCR后双酶切，再进行5ul体系T4连接16℃过夜，加20ul感受态进行转化涂布，挑取长出的单菌落进行培养，结果菌落PCR有片段，但酶切验证无片段。求助各位，到底是哪里的问题，酶切不彻底吗？ 发自小木虫Android客户端 |
回复此楼» 猜你喜欢
Calderasib理化性质与实验操作技术笔记
已经有0人回复
-
RMC-6291怎么用？RAS(ON) 三重复合物工具化合物的实验室实操要点
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有213人回复
-
苯并呋咱全解析：NBD 荧光衍生化试剂母核的化学特性与实验室应用
已经有0人回复
-
生物质炭与活化剂氢氧化钾混合注意事项
已经有0人回复
-
科研人必读：新一代 KRAS G12C 抑制剂 Olomorasib 的研究进展
已经有0人回复
-
BT-11（Omilancor）研究化合物全解析：从分子结构到实验应用要点
已经有0人回复
-
富马酸贝达喹啉：二芳基喹啉类工具化合物的化学特征
已经有0人回复
-
BT投稿with editor状态快两周了，正常吗
已经有25人回复
-
Silevertinib（BDTX-1535）结构拆解：炔基双环片段为何成为合成瓶颈
已经有0人回复
-
RO4929097 解析：双苯并氮杂䓬骨架与 Notch 通路实验设计要点
已经有0人回复
ma08105
铜虫 (著名写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 7484.4
- 散金: 100
- 红花: 2
- 帖子: 1386
- 在线: 250小时
- 虫号: 2192679
- 注册: 2012-12-18
- 性别: GG
- 专业: 质谱分析
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-05-16 07:56:59
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-05-16 07:56:59
|
1、送测序看看 2、会不会是菌落PCR的引物用的是片段上的而不是载体上的 发自小木虫IOS客户端 |
2楼2018-05-15 23:34:46
我后来用空载质粒做PCR发现也能P出跟连接片段长度相仿的片段，所以只能认定做PCR验证是无效的。我的结果出现假阳性，不知道是否是酶切的缘故，我的载体和片段浓度挺高的，不知道这两种酶双酶切多长时间合适，而且这两种酶活都是15U／ul.不知道前辈有没有经验 发自小木虫Android客户端 |
3楼2018-05-16 07:35:59
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
|
这两个酶的酶切效率还是比较高的 不知道你用的是哪个公司的连接酶，连接的时间可以不用这么久，以前Takara、NEB的酶都用，现在基本都用Fermentas的T4，室温连接上几十分钟，连接时间太久会导致假阳性，建议可以减少连接时间，降低背景 然后就是菌落PCR，不知道你鉴定了多少个斑，菌落PCR确实会有假阳性，我一般长的斑少就都挑，多的话挑上十几个，PCR后选择阳性斑，如果阳性斑多，就选择那些条带最强的，这里一定要记住加上对照组，阳性对照可以使用你的插入片段，或者带有插入片段的质粒，证明PCR是成功的，阴性对照为空载体和水作为模板，证明PCR产物是特异的，然后再将阳性克隆摇菌进行酶切鉴定，一般认为酶切鉴定是准确的 如果你的片段不长，也比较好连接，应该是存在阳性克隆的，如果斑长的多，就再多挑几个去鉴定 祝好！ |
4楼2018-05-16 18:50:21
5楼2018-05-16 18:52:56
