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Sal1和sac2双酶切构建表达载体 已有2人参与
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载体用的是pDG160质粒，进行sal1和sac2双酶切3.5小时,连接的片段经PCR后双酶切，再进行5ul体系T4连接16℃过夜，加20ul感受态进行转化涂布，挑取长出的单菌落进行培养，结果菌落PCR有片段，但酶切验证无片段。求助各位，到底是哪里的问题，酶切不彻底吗？ 发自小木虫Android客户端 |
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-05-16 07:56:59
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1、送测序看看 2、会不会是菌落PCR的引物用的是片段上的而不是载体上的 发自小木虫IOS客户端 |
2楼2018-05-15 23:34:46
我后来用空载质粒做PCR发现也能P出跟连接片段长度相仿的片段，所以只能认定做PCR验证是无效的。我的结果出现假阳性，不知道是否是酶切的缘故，我的载体和片段浓度挺高的，不知道这两种酶双酶切多长时间合适，而且这两种酶活都是15U／ul.不知道前辈有没有经验 发自小木虫Android客户端 |
3楼2018-05-16 07:35:59
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这两个酶的酶切效率还是比较高的 不知道你用的是哪个公司的连接酶，连接的时间可以不用这么久，以前Takara、NEB的酶都用，现在基本都用Fermentas的T4，室温连接上几十分钟，连接时间太久会导致假阳性，建议可以减少连接时间，降低背景 然后就是菌落PCR，不知道你鉴定了多少个斑，菌落PCR确实会有假阳性，我一般长的斑少就都挑，多的话挑上十几个，PCR后选择阳性斑，如果阳性斑多，就选择那些条带最强的，这里一定要记住加上对照组，阳性对照可以使用你的插入片段，或者带有插入片段的质粒，证明PCR是成功的，阴性对照为空载体和水作为模板，证明PCR产物是特异的，然后再将阳性克隆摇菌进行酶切鉴定，一般认为酶切鉴定是准确的 如果你的片段不长，也比较好连接，应该是存在阳性克隆的，如果斑长的多，就再多挑几个去鉴定 祝好！ |
4楼2018-05-16 18:50:21
5楼2018-05-16 18:52:56
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