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87115wh木虫 (小有名气)
七吃喀嚓
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[求助]
用石蜡切片做小鼠肠道组织的免疫荧光，一直不出结果
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各位大神，一年级小博求助，目前处于开题阶段，定下来通过免疫荧光的方法，识别组织上目的蛋白的表达位置，但通过4μm石蜡切片做免疫荧光，一直目的蛋白一直没有荧光。。。期间用同样的一抗二抗，通过其他未经石蜡包埋的组织进行实验，发现有荧光，在肠道细胞上做，同样也有荧光，只是用石蜡切片做不出来，实验方法如下： 1. 取小鼠肠道组织，bouin’s液固定4℃ 12h 2. 弃去bouin‘s液，组织于50%乙醇中4℃洗1h，70% 乙醇4℃ 1h洗三次，直至组织发白 3. 制作4μm石蜡切片 4. 石蜡切片室温下风干12h，并于烘箱中65℃孵育30min 5. 脱蜡：分别于二甲苯Ⅰ、Ⅱ及1:1的二甲苯/乙醇中于室温下浸泡20min 6. 再水化： 100%、95%、80%、70%、50%、30%的梯度乙醇，室温下各4min 7. PBS室温下漂洗3次，每次2min 8. 通透液（40mL PBS + 120μL triton-100 ，室温下避光孵育40min 9. PBS室温下漂洗3次，每次2min 11. 0.01M 柠檬酸钠浸泡组织，微波炉中中火15min，或高压灭菌锅121℃ 10min，取出后自然冷却至室温 12. PBS室温下漂洗3次，每次5min 13. 通过体积比为1:20的二抗同源动物血清封闭，37℃ 30min，不洗直接孵一抗 14. 一抗在37℃ 下孵育2h或4℃ 过夜 15. PBS 37℃下漂洗3次，每次15min 16. 二抗-TRITC或二抗-FITC在37℃ 下孵育2h，避光 17. PBS 37℃下漂洗3次，每次15min，避光 18. 通过抗荧光淬灭剂（含DAPI）封片，观察 所测目的蛋白为膜蛋白，DAPI染色效果良好，用凝集素识别其他蛋白效果也很好，就是目的蛋白标记不出来，文章中也有导报通过冰冻切片可以做出荧光染色结果，但小弟冰冻切片技术欠佳，做出来的片子根本无法观察。。。。为了保持组织形态，一直在做石蜡切片，但就是不出结果。。。 在此求助各位大神，感激不尽感激不尽！！！  |
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