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质粒重组构建
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质粒大小为11kb，插入目的片段大小为3200bp， 现在质粒上可用的酶切位点就只有一个Nhe1限制酶位点。 处理方法： 1、质粒单酶切后有去磷酸化处理，但胶回收后浓度不理想； 2、目的片段做ta克隆后胶回收； 3、用T4 dna ligase 16℃连接过夜，20ul体系mol配比做片段：载体为10:1、10:3的体系。化转入大肠杆菌感受态细胞一直没有阳性。 求助： 有木有做过类似重组质粒构建的同学，有成功经验的。分享下你的经验或者我这个方法有什么其他地方需要改进的或者有什么其他的好用的高速效率连接试剂盒好用的介绍一下。 现在实验卡在这里了，两个多月没有进展，都快崩溃了。求各位大神小伙伴经验，一起交流交流。不胜感激！  |
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21楼2018-06-06 11:09:56
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drwhoknowss: 金币+1, 鼓励交流 2018-04-19 20:39:06
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可以试试无缝克隆，但是前提是质粒浓度要上去 发自小木虫Android客户端 |
3楼2018-04-19 16:36:26
★ ★
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我构建过这种，不用连接酶，用的同源重组方法，好多家都用卖。NEB的贵，天根，翊圣家也都有，我都用过。 发自小木虫Android客户端 |
5楼2018-04-19 16:53:53
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7楼2018-04-19 23:09:51
8楼2018-04-20 08:51:01
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16楼2018-04-20 14:23:40
17楼2018-04-20 14:32:51
18楼2018-04-20 17:59:23
★
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| 首先，你的质粒片段和基因片段都很长，这种是不好连的。这就要求1、质粒和片段浓度不能低，2、可以适当延长连接时间，3、Nhe I酶切效率很低，再保证不表现星号活性的前提下，尽可能长时间的酶切。酶切反应体系加入的模板的量减半。可以邮箱交流 dgb706@qq.com |
19楼2018-04-23 10:37:58
20楼2018-05-16 13:47:18
22楼2018-06-06 13:42:55
23楼2018-06-07 09:16:11
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24楼2018-06-08 19:36:17
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nono20092楼
2018-04-19 16:36
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aishida4楼
2018-04-19 16:51
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雾霾天20136楼
2018-04-19 17:35
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