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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 质粒重组构建
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懒懒的猫咪

新虫 (初入文坛)

[交流] 质粒重组构建

质粒大小为11kb，插入目的片段大小为3200bp，
现在质粒上可用的酶切位点就只有一个Nhe1限制酶位点。
处理方法：
                  1、质粒单酶切后有去磷酸化处理，但胶回收后浓度不理想；
                  2、目的片段做ta克隆后胶回收；
                  3、用T4 dna ligase 16℃连接过夜，20ul体系mol配比做片段：载体为10:1、10:3的体系。化转入大肠杆菌感受态细胞一直没有阳性。
求助：
                有木有做过类似重组质粒构建的同学，有成功经验的。分享下你的经验或者我这个方法有什么其他地方需要改进的或者有什么其他的好用的高速效率连接试剂盒好用的介绍一下。
    现在实验卡在这里了，两个多月没有进展，都快崩溃了。求各位大神小伙伴经验，一起交流交流。不胜感激！
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1楼 2018-04-19 16:06:07
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懒懒的猫咪

新虫 (初入文坛)
连接成功了，换了一个高效率的感受态细胞。谢谢大家
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21楼2018-06-06 11:09:56
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渊博震天

版主 (职业作家)
★ ★
懒懒的猫咪(金币+1): 谢谢参与
drwhoknowss: 金币+1, 鼓励交流 2018-04-19 20:39:06
可以试试无缝克隆，但是前提是质粒浓度要上去

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3楼2018-04-19 16:36:26
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不吃M的鱼

金虫 (小有名气)
★ ★
懒懒的猫咪(金币+1): 谢谢参与
drwhoknowss: 金币+1, 鼓励交流 2018-04-19 20:39:14
我构建过这种，不用连接酶，用的同源重组方法，好多家都用卖。NEB的贵，天根，翊圣家也都有，我都用过。

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5楼2018-04-19 16:53:53
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linhaobua

禁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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7楼2018-04-19 23:09:51
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懒懒的猫咪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-04-19 16:36:26
可以试试无缝克隆，但是前提是质粒浓度要上去

无缝克隆，是类似于同源重组吗？我们有用过，这个质粒就是用无缝克隆连接的。现在要在这个质粒的另一个位置上再串联构建。开始有用这方法没有成功。
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8楼2018-04-20 08:51:01
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懒懒的猫咪

新虫 (初入文坛)
内容已删除
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9楼2018-04-20 08:55:31
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懒懒的猫咪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by linhaobua at 2018-04-19 23:09:51
你好，能用站内信联系嘛，这样可以更具体的交流一下
我的邮箱linhaocau163.com

这个我不太常用。我qq邮箱联系你吧
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10楼2018-04-20 08:56:47
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懒懒的猫咪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-04-19 16:36:26
可以试试无缝克隆，但是前提是质粒浓度要上去

浓度提上去确实也是我们遇到的问题，大神有没有什么方法把浓度提上去
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11楼2018-04-20 09:22:03
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渊博震天

版主 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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11楼: Originally posted by 懒懒的猫咪 at 2018-04-20 09:22:03
浓度提上去确实也是我们遇到的问题，大神有没有什么方法把浓度提上去...

你们酶切掉的片段长不长，不长的话可以试试PCR产物回收试剂盒回收。如果酶切掉片段很长的话，那就多切几管，最后集中到一个管里统一回收
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12楼2018-04-20 10:05:43
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懒懒的猫咪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-04-20 10:05:43
你们酶切掉的片段长不长，不长的话可以试试PCR产物回收试剂盒回收。如果酶切掉片段很长的话，那就多切几管，最后集中到一个管里统一回收...

有11kb，直接PCR 怕有质粒存留，就跑胶回收了
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13楼2018-04-20 11:49:08
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渊博震天

版主 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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13楼: Originally posted by 懒懒的猫咪 at 2018-04-20 11:49:08
有11kb，直接PCR 怕有质粒存留，就跑胶回收了...

直接PCR完之后听说可以用Kpn I处理消化掉质粒的操作喔

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14楼2018-04-20 11:53:50
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懒懒的猫咪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-04-20 11:53:50
直接PCR完之后听说可以用Kpn I处理消化掉质粒的操作喔
...

Kpn1酶？这个不行我的质粒里有这个酶切位点
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15楼2018-04-20 14:22:23
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懒懒的猫咪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-04-20 11:53:50
直接PCR完之后听说可以用Kpn I处理消化掉质粒的操作喔
...

你讲的是Dpn1吧
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16楼2018-04-20 14:23:40
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懒懒的猫咪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-04-20 11:53:50
直接PCR完之后听说可以用Kpn I处理消化掉质粒的操作喔
...

dpn1去质粒的原理是是消化掉甲基化的质粒。而我们做的是酶切。
如果是质粒是甲基化的质粒，我们酶切就是切开，你用dpn1处理就会把质粒都消化掉了。
如果是非甲基化的质粒，那你的dpn1 酶是没有作用的。
所以这个对pcr才有用。
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17楼2018-04-20 14:32:51
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渊博震天

版主 (职业作家)
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17楼: Originally posted by 懒懒的猫咪 at 2018-04-20 14:32:51
dpn1去质粒的原理是是消化掉甲基化的质粒。而我们做的是酶切。
如果是质粒是甲基化的质粒，我们酶切就是切开，你用dpn1处理就会把质粒都消化掉了。
如果是非甲基化的质粒，那你的dpn1 酶是没有作用的。
所以这个 ...

嗯嗯

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18楼2018-04-20 17:59:23
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donggb2012

银虫 (初入文坛)
★
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首先，你的质粒片段和基因片段都很长，这种是不好连的。这就要求1、质粒和片段浓度不能低，2、可以适当延长连接时间，3、Nhe I酶切效率很低，再保证不表现星号活性的前提下，尽可能长时间的酶切。酶切反应体系加入的模板的量减半。可以邮箱交流 dgb706@qq.com
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19楼2018-04-23 10:37:58
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leister

新虫 (小有名气)
★
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片段这么大是不容易。T4 ligase 的克隆关键是尽可能保证转化效率，买上好的感受态细菌如 TOP10。严格按说明操作。
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20楼2018-05-16 13:47:18
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2011sp

铁杆木虫 (著名写手)
★
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无缝连接外源片段大小有限制

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22楼2018-06-06 13:42:55
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生化试剂专家

铁虫 (初入文坛)
★
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你测过浓度吗？建议测测切完的载体浓度和目的片段浓度，不过TA克隆上切下来的话目的片段浓度应该挺高的，测完浓度比例你可以试着调一调，以前我们经常这么干，祝科研顺利
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23楼2018-06-07 09:16:11
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王查查23

禁虫 (小有名气)
★
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24楼2018-06-08 19:36:17
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nono20092楼
2018-04-19 16:36   回复  
懒懒的猫咪(金币+1): 谢谢参与
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aishida4楼
2018-04-19 16:51   回复  
懒懒的猫咪(金币+1): 谢谢参与
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雾霾天20136楼
2018-04-19 17:35   回复  
懒懒的猫咪(金币+1): 谢谢参与
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