应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 质粒重组构建
241/1返回列表
查看: 5386  |  回复: 23
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

懒懒的猫咪

新虫 (初入文坛)

[交流] 质粒重组构建

质粒大小为11kb，插入目的片段大小为3200bp，
现在质粒上可用的酶切位点就只有一个Nhe1限制酶位点。
处理方法：
                  1、质粒单酶切后有去磷酸化处理，但胶回收后浓度不理想；
                  2、目的片段做ta克隆后胶回收；
                  3、用T4 dna ligase 16℃连接过夜，20ul体系mol配比做片段：载体为10:1、10:3的体系。化转入大肠杆菌感受态细胞一直没有阳性。
求助：
                有木有做过类似重组质粒构建的同学，有成功经验的。分享下你的经验或者我这个方法有什么其他地方需要改进的或者有什么其他的好用的高速效率连接试剂盒好用的介绍一下。
    现在实验卡在这里了，两个多月没有进展，都快崩溃了。求各位大神小伙伴经验，一起交流交流。不胜感激！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2018-04-19 16:06:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

懒懒的猫咪

新虫 (初入文坛)
连接成功了，换了一个高效率的感受态细胞。谢谢大家
赞一下(1人) 回复此楼
21楼2018-06-06 11:09:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

渊博震天

版主 (职业作家)
★ ★
懒懒的猫咪(金币+1): 谢谢参与
drwhoknowss: 金币+1, 鼓励交流 2018-04-19 20:39:06
可以试试无缝克隆，但是前提是质粒浓度要上去

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
3楼2018-04-19 16:36:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

不吃M的鱼

金虫 (小有名气)
★ ★
懒懒的猫咪(金币+1): 谢谢参与
drwhoknowss: 金币+1, 鼓励交流 2018-04-19 20:39:14
我构建过这种，不用连接酶，用的同源重组方法，好多家都用卖。NEB的贵，天根，翊圣家也都有，我都用过。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
5楼2018-04-19 16:53:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

linhaobua

禁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
7楼2018-04-19 23:09:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

懒懒的猫咪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-04-19 16:36:26
可以试试无缝克隆，但是前提是质粒浓度要上去

无缝克隆，是类似于同源重组吗？我们有用过，这个质粒就是用无缝克隆连接的。现在要在这个质粒的另一个位置上再串联构建。开始有用这方法没有成功。
赞一下 回复此楼
8楼2018-04-20 08:51:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

懒懒的猫咪

新虫 (初入文坛)
内容已删除
回复此楼
9楼2018-04-20 08:55:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

懒懒的猫咪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by linhaobua at 2018-04-19 23:09:51
你好，能用站内信联系嘛，这样可以更具体的交流一下
我的邮箱linhaocau163.com

这个我不太常用。我qq邮箱联系你吧
赞一下 回复此楼
10楼2018-04-20 08:56:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

懒懒的猫咪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-04-19 16:36:26
可以试试无缝克隆，但是前提是质粒浓度要上去

浓度提上去确实也是我们遇到的问题，大神有没有什么方法把浓度提上去
赞一下 回复此楼
11楼2018-04-20 09:22:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

渊博震天

版主 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
11楼: Originally posted by 懒懒的猫咪 at 2018-04-20 09:22:03
浓度提上去确实也是我们遇到的问题，大神有没有什么方法把浓度提上去...

你们酶切掉的片段长不长，不长的话可以试试PCR产物回收试剂盒回收。如果酶切掉片段很长的话，那就多切几管，最后集中到一个管里统一回收
赞一下 回复此楼
12楼2018-04-20 10:05:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

懒懒的猫咪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-04-20 10:05:43
你们酶切掉的片段长不长，不长的话可以试试PCR产物回收试剂盒回收。如果酶切掉片段很长的话，那就多切几管，最后集中到一个管里统一回收...

有11kb，直接PCR 怕有质粒存留，就跑胶回收了
赞一下 回复此楼
13楼2018-04-20 11:49:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

渊博震天

版主 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
13楼: Originally posted by 懒懒的猫咪 at 2018-04-20 11:49:08
有11kb，直接PCR 怕有质粒存留，就跑胶回收了...

直接PCR完之后听说可以用Kpn I处理消化掉质粒的操作喔

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
14楼2018-04-20 11:53:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

懒懒的猫咪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-04-20 11:53:50
直接PCR完之后听说可以用Kpn I处理消化掉质粒的操作喔
...

Kpn1酶？这个不行我的质粒里有这个酶切位点
赞一下 回复此楼
15楼2018-04-20 14:22:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

懒懒的猫咪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-04-20 11:53:50
直接PCR完之后听说可以用Kpn I处理消化掉质粒的操作喔
...

你讲的是Dpn1吧
回复此楼
16楼2018-04-20 14:23:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

懒懒的猫咪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-04-20 11:53:50
直接PCR完之后听说可以用Kpn I处理消化掉质粒的操作喔
...

dpn1去质粒的原理是是消化掉甲基化的质粒。而我们做的是酶切。
如果是质粒是甲基化的质粒，我们酶切就是切开，你用dpn1处理就会把质粒都消化掉了。
如果是非甲基化的质粒，那你的dpn1 酶是没有作用的。
所以这个对pcr才有用。
赞一下 回复此楼
17楼2018-04-20 14:32:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

渊博震天

版主 (职业作家)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 懒懒的猫咪 at 2018-04-20 14:32:51
dpn1去质粒的原理是是消化掉甲基化的质粒。而我们做的是酶切。
如果是质粒是甲基化的质粒，我们酶切就是切开，你用dpn1处理就会把质粒都消化掉了。
如果是非甲基化的质粒，那你的dpn1 酶是没有作用的。
所以这个 ...

嗯嗯

发自小木虫Android客户端
回复此楼
18楼2018-04-20 17:59:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

donggb2012

银虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
首先，你的质粒片段和基因片段都很长，这种是不好连的。这就要求1、质粒和片段浓度不能低，2、可以适当延长连接时间，3、Nhe I酶切效率很低，再保证不表现星号活性的前提下，尽可能长时间的酶切。酶切反应体系加入的模板的量减半。可以邮箱交流 dgb706@qq.com
赞一下 回复此楼
19楼2018-04-23 10:37:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

leister

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
片段这么大是不容易。T4 ligase 的克隆关键是尽可能保证转化效率，买上好的感受态细菌如 TOP10。严格按说明操作。
赞一下 回复此楼
20楼2018-05-16 13:47:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

2011sp

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
无缝连接外源片段大小有限制

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
22楼2018-06-06 13:42:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

生化试剂专家

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你测过浓度吗？建议测测切完的载体浓度和目的片段浓度，不过TA克隆上切下来的话目的片段浓度应该挺高的，测完浓度比例你可以试着调一调，以前我们经常这么干，祝科研顺利
赞一下 回复此楼
23楼2018-06-07 09:16:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王查查23

禁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
24楼2018-06-08 19:36:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
简单回复
nono20092楼
2018-04-19 16:36   回复  
懒懒的猫咪(金币+1): 谢谢参与
·
aishida4楼
2018-04-19 16:51   回复  
懒懒的猫咪(金币+1): 谢谢参与
发自小木虫Android客户端
雾霾天20136楼
2018-04-19 17:35   回复  
懒懒的猫咪(金币+1): 谢谢参与
相关版块跳转 我要订阅楼主 懒懒的猫咪 的主题更新
241/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭