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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 目标条带9.6k的PCR老是不成功
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diaomou

新虫 (小有名气)

[交流] 目标条带9.6k的PCR老是不成功 已有1人参与

用过日本的KOD FX NEO，结果有一次产物跑不出孔。用减少质粒模板量后，条带弥散。。又用过诺唯赞的phanta max master mix，结果还是条带弥散。

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1楼 2018-04-10 18:28:53
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GRUBBY_WU

铁杆木虫 (著名写手)
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KOD FX加一些DMSO效果比较好，还有，这两只酶都试过了，不介意再试试NEB的phusion吧
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2019更好更棒!
2楼2018-04-10 18:36:11
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diaomou

新虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by GRUBBY_WU at 2018-04-10 18:36:11
KOD FX加一些DMSO效果比较好，还有，这两只酶都试过了，不介意再试试NEB的phusion吧

会不会退火30秒时间太长了，导致条带弥散？94度或98度变性温度太高了，对于长片段变性温度要降到92度？

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3楼2018-04-10 23:09:55
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GRUBBY_WU

铁杆木虫 (著名写手)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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3楼: Originally posted by diaomou at 2018-04-10 23:09:55
会不会退火30秒时间太长了，导致条带弥散？94度或98度变性温度太高了，对于长片段变性温度要降到92度？
...

我觉着问题不大，toyobo的kod plus和neb的phusion变性温度都是98°，退火时间10-30s影响不大。非要一次性扩增出来只能优化体系做。也可以考虑下分段p，重组连接起来。
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2019更好更棒!
4楼2018-04-11 10:37:48
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diaomou

新虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by GRUBBY_WU at 2018-04-10 18:36:11
KOD FX加一些DMSO效果比较好，还有，这两只酶都试过了，不介意再试试NEB的phusion吧

其实我以前做过phusion聚合酶，不知道序列，但是表达纯化方法都有，可惜现在的公司不开发这个

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5楼2018-04-11 12:29:34
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diaomou

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by GRUBBY_WU at 2018-04-11 10:37:48
我觉着问题不大，toyobo的kod plus和neb的phusion变性温度都是98°，退火时间10-30s影响不大。非要一次性扩增出来只能优化体系做。也可以考虑下分段p，重组连接起来。...

你说对了，我看说明书上说退火时间长了，可能让条带弥散。大于10k产物要降低变性温度到92度。试了，还是弥散。

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6楼2018-04-11 13:04:38
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