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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » 表达蛋白大小问题
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xht

铜虫 (小有名气)

[交流] 表达蛋白大小问题

想请教各位大虾，我把一个900bp的基因插入到pet30a中，转化入BL21表达，目的蛋白大小应该是30k左右，为什么最后测酶活，发现有一个50多k的蛋白有活性，而大量表达的30多k的蛋白却没有活性。我跑的是SDS-PAGE，所以应该不会是二聚体，而且在没有这个基因，仅有空载体的BL21中没有这种活性，这究竟是怎么回事呢？
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1楼 2009-03-16 22:15:20
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
★
xht(金币+1,VIP+0):谢谢了,可是要怎么解释载体序列加蛋白本身序列,会产生我要的活性?如果一个单体大小是32左右,那二聚体可能是50多么?谢谢了 3-17 11:32
有些聚体是打不开的
是不是载体上还有一段序列也表达了
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2楼2009-03-17 08:21:13
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xht

铜虫 (小有名气)

继续提问

可是这个大的蛋白是有活性的蛋白,怎么解释载体上的序列,加上蛋白基因本身的序列而产生的蛋白,却恰好有我要的活性呢?
如果一个单体大小是32左右,那二聚体可能是五十七八左右么?谢谢了

[ Last edited by xht on 2009-3-17 at 11:33 ]
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3楼2009-03-17 11:30:08
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36678293

铜虫 (正式写手)
蛋白质之中是否有Cys？如果有的话，就极有可能！
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4楼2009-03-18 02:17:21
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
★
xht(金币+1,VIP+0):谢谢 5-27 22:33
(1)载体有无TAG
(2)你的蛋白的活性形式是否是二聚体
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5楼2009-03-18 08:10:36
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jqq1985

银虫 (正式写手)
可能二聚体是稳定共价键连接，是没有办法用SDS打开的。N端测序看看
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6楼2009-03-18 10:23:11
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xht

铜虫 (小有名气)

再次提问

两个Cys就够了么?一个在中间点,另一个貌似在一端.我现在也不清楚是不是活性形式是二聚体,载体只有一个组氨酸标签,如果是二聚体,用那个His纯化的试剂盒也能把二聚体一起纯出来么? 现在还有一个问题就是,我们的纯化条件不好,老师还不太想给买试剂盒,这个问题还有点棘手.
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7楼2009-03-18 11:18:56
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winter_gates

金虫 (正式写手)

生命过客
测序正确吗？
做过western bolting没？
或者非变性胶，原位显色。
没有验证，不好有结论。
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For my life！
8楼2009-03-18 11:20:41
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winter_gates

金虫 (正式写手)

生命过客
★
xht(金币+1,VIP+0):谢谢了 3-18 14:45
引用回帖:
Originally posted by xht at 2009-3-18 11:18:
两个Cys就够了么?一个在中间点,另一个貌似在一端.我现在也不清楚是不是活性形式是二聚体,载体只有一个组氨酸标签,如果是二聚体,用那个His纯化的试剂盒也能把二聚体一起纯出来么? 现在还有一个问题就是,我们的纯化 ...

his纯化才不管你有没有二聚体，只要有标签就能纯化。这个是竞争的手段，与你的蛋白无关。
ps：SDS-PAGE的话，二聚体不被打开的可能性基本上没有。我一个专门的蛋白会形成多聚体，而且化学性质很稳定的蛋白在loading buffer里面照样歇菜
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For my life！
9楼2009-03-18 11:23:06
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xht

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by winter_gates at 2009-3-18 11:20:
测序正确吗？
做过western bolting没？
或者非变性胶，原位显色。
没有验证，不好有结论。

我做过相应酶的原位显色 结果确是指向分子量大的蛋白 我实在是搞不懂了
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10楼2009-03-18 14:48:46
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