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xht

铜虫 (小有名气)

[交流] 表达蛋白大小问题

想请教各位大虾,我把一个900bp的基因插入到pet30a中,转化入BL21表达,目的蛋白大小应该是30k左右,为什么最后测酶活,发现有一个50多k的蛋白有活性,而大量表达的30多k的蛋白却没有活性。我跑的是SDS-PAGE,所以应该不会是二聚体,而且在没有这个基因,仅有空载体的BL21中没有这种活性,这究竟是怎么回事呢?
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)


xht(金币+1,VIP+0):谢谢了,可是要怎么解释载体序列加蛋白本身序列,会产生我要的活性?如果一个单体大小是32左右,那二聚体可能是50多么?谢谢了 3-17 11:32
有些聚体是打不开的
是不是载体上还有一段序列也表达了
2楼2009-03-17 08:21:13
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xht

铜虫 (小有名气)

继续提问

可是这个大的蛋白是有活性的蛋白,怎么解释载体上的序列,加上蛋白基因本身的序列而产生的蛋白,却恰好有我要的活性呢?
如果一个单体大小是32左右,那二聚体可能是五十七八左右么?谢谢了

[ Last edited by xht on 2009-3-17 at 11:33 ]
3楼2009-03-17 11:30:08
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36678293

铜虫 (正式写手)

蛋白质之中是否有Cys?如果有的话,就极有可能!
4楼2009-03-18 02:17:21
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)


xht(金币+1,VIP+0):谢谢 5-27 22:33
(1)载体有无TAG
(2)你的蛋白的活性形式是否是二聚体
5楼2009-03-18 08:10:36
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jqq1985

银虫 (正式写手)

可能二聚体是稳定共价键连接,是没有办法用SDS打开的。N端测序看看
6楼2009-03-18 10:23:11
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xht

铜虫 (小有名气)

再次提问

两个Cys就够了么?一个在中间点,另一个貌似在一端.我现在也不清楚是不是活性形式是二聚体,载体只有一个组氨酸标签,如果是二聚体,用那个His纯化的试剂盒也能把二聚体一起纯出来么? 现在还有一个问题就是,我们的纯化条件不好,老师还不太想给买试剂盒,这个问题还有点棘手.
7楼2009-03-18 11:18:56
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winter_gates

金虫 (正式写手)

生命过客

测序正确吗?
做过western bolting没?
或者非变性胶,原位显色。
没有验证,不好有结论。
For my life!
8楼2009-03-18 11:20:41
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winter_gates

金虫 (正式写手)

生命过客


xht(金币+1,VIP+0):谢谢了 3-18 14:45
引用回帖:
Originally posted by xht at 2009-3-18 11:18:
两个Cys就够了么?一个在中间点,另一个貌似在一端.我现在也不清楚是不是活性形式是二聚体,载体只有一个组氨酸标签,如果是二聚体,用那个His纯化的试剂盒也能把二聚体一起纯出来么? 现在还有一个问题就是,我们的纯化 ...

his纯化才不管你有没有二聚体,只要有标签就能纯化。这个是竞争的手段,与你的蛋白无关。
ps:SDS-PAGE的话,二聚体不被打开的可能性基本上没有。我一个专门的蛋白会形成多聚体,而且化学性质很稳定的蛋白在loading buffer里面照样歇菜
For my life!
9楼2009-03-18 11:23:06
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xht

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by winter_gates at 2009-3-18 11:20:
测序正确吗?
做过western bolting没?
或者非变性胶,原位显色。
没有验证,不好有结论。

我做过相应酶的原位显色 结果确是指向分子量大的蛋白 我实在是搞不懂了
10楼2009-03-18 14:48:46
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