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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » Gibson连接和T4连接酶连接总是把不成功
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15623507725

新虫 (初入文坛)

[求助] Gibson连接和T4连接酶连接总是把不成功 已有1人参与

目前在构建一个载体，用了两种方法：一个是Gibson连接，将骨架双酶切切开，然后将与骨架带有同源臂的片段用Gibson酶连接，然后再转化，菌落PCR验证出来的条带和我的目的条带总是不同，送去测序也不对；后来改用在连接片段前后加上酶切位点和保护碱基，转化出来的板一个菌落都没有。将片段送去测序也没有发现什么问题，感受态也没问题，这个实验反反复复做了快两个月了，就是没有进展。哪位大神能够给点思路，我号继续往下做。谢谢啦！@天使托
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1楼 2018-03-19 15:23:59
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主
模板和目的基因浓度高不高？

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2楼2018-03-19 15:28:50
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15623507725

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-03-19 15:28:50
模板和目的基因浓度高不高？

不太高，在做T4连接的时候，骨架浓度只有10ng/ul,片段浓度是37ng/ul,骨架和片段比做了1：3和1:5两种体系，转化后就是不长。还有就是我双酶切后可以直接用Gibson连吗？
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3楼2018-03-19 15:56:09
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主
双酶切后尽量纯化一下子吧，浓度高的话连着会高效

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4楼2018-03-19 16:08:24
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15623507725

新虫 (初入文坛)
纯化了的，过夜酶切后都有做纯化。找了好多原因就是找不到问题的关键所在。

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5楼2018-03-19 16:13:49
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GRUBBY_WU

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先，Gibson连接是不依赖于限制性酶切位点的克隆方法，具有5->3外切酶活性的酶能将线性化的载体和插入片段相同的同源臂消化（chew back）产生相同的黏性末端（长度一般15-40nt），再用T4 DNA连接酶连起来。既然能用双酶切做克隆，那肯定首选酶切连接。酶切的作用也是产生相同的黏性末端。
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2019更好更棒!
6楼2018-03-19 21:33:28
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15623507725

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by GRUBBY_WU at 2018-03-19 21:33:28
首先，Gibson连接是不依赖于限制性酶切位点的克隆方法，具有5->3外切酶活性的酶能将线性化的载体和插入片段相同的同源臂消化（chew back）产生相同的黏性末端（长度一般15-40nt），再用T4 DNA连接酶连起来。 ...

现在已经用T4连接酶连接了，可就是连不上。不知道问题在哪里。

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7楼2018-03-20 12:18:54
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猪妹妹May

铁虫 (初入文坛)
请问后来有解决Gibson连接效率的问题吗？
我的质粒重组必须要用Gibson，但是Gibson涂得板子都长不出来，连接效率很低。。
找不到问题所在。
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8楼2018-11-30 19:48:21
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xinxinjin

银虫 (职业作家)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 猪妹妹May at 2018-11-30 19:48:21
请问后来有解决Gibson连接效率的问题吗？
我的质粒重组必须要用Gibson，但是Gibson涂得板子都长不出来，连接效率很低。。
找不到问题所在。

你好，我以前都用T4连接酶，现在想用Gibson连接，载体9k，目的基因5k，这个连接 如何？

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9楼2019-04-04 15:15:28
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Mary Jane

新虫 (初入文坛)
想请问一下您现在解决了吗
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10楼2022-02-10 16:06:55
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