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新虫 (初入文坛)

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专业: 微生物学

[求助] Gibson连接和T4连接酶连接总是把不成功已有1人参与

目前在构建一个载体，用了两种方法：一个是Gibson连接，将骨架双酶切切开，然后将与骨架带有同源臂的片段用Gibson酶连接，然后再转化，菌落PCR验证出来的条带和我的目的条带总是不同，送去测序也不对；后来改用在连接片段前后加上酶切位点和保护碱基，转化出来的板一个菌落都没有。将片段送去测序也没有发现什么问题，感受态也没问题，这个实验反反复复做了快两个月了，就是没有进展。哪位大神能够给点思路，我号继续往下做。谢谢啦！@天使托

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1楼2018-03-19 15:23:59

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GRUBBY_WU

铁杆木虫 (著名写手)

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专业: 人类遗传学

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

首先，Gibson连接是不依赖于限制性酶切位点的克隆方法，具有5->3外切酶活性的酶能将线性化的载体和插入片段相同的同源臂消化（chew back）产生相同的黏性末端（长度一般15-40nt），再用T4 DNA连接酶连起来。既然能用双酶切做克隆，那肯定首选酶切连接。酶切的作用也是产生相同的黏性末端。