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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 基因克隆求助！！
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vegence

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因克隆求助！！

现在情况是我要克隆某基因cDNA序列，已知的是有该基因的cDS序列（3400bp）信息（师姐之前分段测序得出），我想克隆包括cds序列以及5’和3'非编码区的cDNA全长，以CDS序列为模板分段设计了两对引物，第一对引物的下游和第二对引物的上游互补，想用重组PCR方法扩出大部分cds序列（5'端和3'端各有50bp左右因不好设计引物，没在扩增范围内），我想问的是我这个思路对不对，接下来该怎么办？另外在NCBI上有预测的该基因的mRNA序列，之前也想用这个直接设计来着，怕有突变没敢这么设计。我接下来该怎么办？求解答！！！

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1楼 2018-03-18 20:14:17
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1272356152

新虫 (正式写手)
直接设计

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2楼2018-03-18 20:17:09
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vegence

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 1272356152 at 2018-03-18 20:17:09
直接设计

可是那个是预测的序列，直接用那个设计可以嘛？

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3楼2018-03-18 21:15:31
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vegence

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 1272356152 at 2018-03-18 20:17:09
直接设计

另外如果要是扩CDS序列的话，我这种情况该咋扩

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4楼2018-03-18 21:31:12
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KNSS-Bio

新虫 (小有名气)
直接按照NCBI设计，用高保真酶扩增后连T载体测序看看就可以，如果有个别突变可以后面

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5楼2018-03-18 21:52:09
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vegence

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by KNSS-Bio at 2018-03-18 21:52:09
直接按照NCBI设计，用高保真酶扩增后连T载体测序看看就可以，如果有个别突变可以后面

好的，谢谢你，还有一个问题，就是设计引物时候，5’和3’两端的引物不好设计，条件总是达不到要求该咋办。

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6楼2018-03-19 07:52:12
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KNSS-Bio

新虫 (小有名气)
这种情况看

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7楼2018-03-19 09:13:45
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KNSS-Bio

新虫 (小有名气)
这种情况可以先设计一下可扩增的区域，如果5'和3'端剩余区域不是特别长，可以再设计一对外部引物搭上去，实在不行可以合成

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8楼2018-03-19 09:16:14
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