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vegence

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因克隆求助!!

现在情况是我要克隆某基因cDNA序列,已知的是有该基因的cDS序列(3400bp)信息(师姐之前分段测序得出),我想克隆包括cds序列以及5’和3'非编码区的cDNA全长,以CDS序列为模板分段设计了两对引物,第一对引物的下游和第二对引物的上游互补,想用重组PCR方法扩出大部分cds序列(5'端和3'端各有50bp左右因不好设计引物,没在扩增范围内),我想问的是我这个思路对不对,接下来该怎么办?另外在NCBI上有预测的该基因的mRNA序列,之前也想用这个直接设计来着,怕有突变没敢这么设计。我接下来该怎么办?求解答!!!

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1272356152

新虫 (正式写手)

2楼2018-03-18 20:17:09
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vegence

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 1272356152 at 2018-03-18 20:17:09
直接设计

可是那个是预测的序列,直接用那个设计可以嘛?

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3楼2018-03-18 21:15:31
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vegence

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 1272356152 at 2018-03-18 20:17:09
直接设计

另外如果要是扩CDS序列的话,我这种情况该咋扩

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4楼2018-03-18 21:31:12
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KNSS-Bio

新虫 (小有名气)

直接按照NCBI设计,用高保真酶扩增后连T载体测序看看就可以,如果有个别突变可以后面

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5楼2018-03-18 21:52:09
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vegence

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by KNSS-Bio at 2018-03-18 21:52:09
直接按照NCBI设计,用高保真酶扩增后连T载体测序看看就可以,如果有个别突变可以后面

好的,谢谢你,还有一个问题,就是设计引物时候,5’和3’两端的引物不好设计,条件总是达不到要求该咋办。

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6楼2018-03-19 07:52:12
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KNSS-Bio

新虫 (小有名气)

7楼2018-03-19 09:13:45
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KNSS-Bio

新虫 (小有名气)

这种情况可以先设计一下可扩增的区域,如果5'和3'端剩余区域不是特别长,可以再设计一对外部引物搭上去,实在不行可以合成

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8楼2018-03-19 09:16:14
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