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虫子739

铁虫 (小有名气)

[交流] RT-PCR

RT-PCR需要获得1500bp左右的片段，可是我做了几次反转录都没出现目的条带。用内参引物做的RT-PCR，条带与理论相符合。是因为目的条带太大？还是目的基因的转录水平太低？PCR的条件是不是要很特殊，希望有经验的同仁指点迷津！谢谢！~
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1楼 2009-03-11 16:19:18
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
sutao1979(金币+1,VIP+0):应该是这样 3-11 17:35
RT检测表达量无需扩这么长，不超过500bp
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2楼2009-03-11 16:28:16
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亦木水

铜虫 (小有名气)
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):辛苦,欢迎常来~ 3-14 00:59
我现在遇到同样的问题，我的目的条带是2.5kb的，已经做了快一个月了
可以检查RNA的纯度
把RT-PCR第一步逆转录所得cDNA电泳，看是否有结果
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3楼2009-03-12 00:06:13
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虫子739

铁虫 (小有名气)
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):鼓励新虫~ 3-14 00:59
cDNA电泳回出现条带吗？要是那样能出来了，我们不就可以不作PCR了？直接做RT就好了。
你那样电泳有结果吗？
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4楼2009-03-13 18:14:54
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虫子739

铁虫 (小有名气)

补充

请问高手们，一般反转录能合成多长的片段？怎么合成长片段呢？
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5楼2009-03-13 18:17:27
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
反转录理论上多长都可以弄出来，只要用好的酶
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6楼2009-03-13 19:57:46
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sail000000

铜虫 (小有名气)
★ ★
lwf991229(金币+2,VIP+0):感谢参与讨论,欢迎常来~ 3-14 01:00
引用回帖:
Originally posted by 虫子739 at 2009-3-11 16:19:
RT-PCR需要获得1500bp左右的片段，可是我做了几次反转录都没出现目的条带。用内参引物做的RT-PCR，条带与理论相符合。是因为目的条带太大？还是目的基因的转录水平太低？

做内参能做出来说明你的模板是没问题的，目的条带不出来可能是你的体系、程序没找对，还有可能是表达量太低。
你做的如果是别人做过的已知基因，你可以看看别人文献里有没有做表达分析的，看看你的基因有没有基础表达，如果是诱导才表达、生长的某一个时段才表达的话，你就要找准采样的时间了！
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7楼2009-03-14 00:55:24
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虫子739

铁虫 (小有名气)
谢谢，说的很有道理！资料显示目的基因是能表达的，但目的基因总是扩增无果！难道是我的目的引物不合适？请问大家有没有在调节PCR体系及PCR条件方面的经验。希望做过RT-PCR的高手给点指点，先谢谢了！
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8楼2009-03-16 13:09:22
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sail000000

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 虫子739 at 2009-3-16 13:09:
谢谢，说的很有道理！资料显示目的基因是能表达的，但目的基因总是扩增无果！难道是我的目的引物不合适？请问大家有没有在调节PCR体系及PCR条件方面的经验。希望做过RT-PCR的高手给点指点，先谢谢了！

这几天比较忙，今天才上来，不知道你P出来没有，如果还没有把你的体系、程序详细的写上来，帮你看看吧！
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9楼2009-03-25 10:07:31
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虫子739

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 虫子739 at 2009-3-16 13:09:
谢谢，说的很有道理！资料显示目的基因是能表达的，但目的基因总是扩增无果！难道是我的目的引物不合适？请问大家有没有在调节PCR体系及PCR条件方面的经验。希望做过RT-PCR的高手给点指点，先谢谢了！

谢谢关心！我的内参pcr结果总是不稳定！我重新设计了目的基因，分别用去年的和今年的cDNA为模板，去年的cDNA能扩出目的基因，今年的模板就不行！
结果老是这样不稳定的话，我就不能大量做半定量！
我怀疑内参可能不太合适。
我的PCR体系(20ul体系）：2*Taq 10ul; cDNA模板2ul; 引物1ul（浓度为20uM)；ddH2O 7ul.
PCR条件：95℃，4`30``;94℃30``, 55℃, 30``,72℃ 1`35个循环；72度再延伸7分钟。
请问这条件有问题吗？
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10楼2009-03-25 16:45:52
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