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亲爱的不饿

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助 蛋白纯化不出来 每次都有杂带 想哭....已有4人参与

用的康为世纪包涵体纯化试剂盒。binding buffer 中的咪唑浓度为5mM,洗杂蛋白也是5mM的,这次做了梯度洗脱,10,50,100,150,200,250,300,350,500,如下图图一。另一张图是以前用500mM咪唑洗脱的 ,梯度洗脱也洗不到纯的 好想哭,做了两个月的纯化了

求助 蛋白纯化不出来 每次都有杂带 想哭....


求助 蛋白纯化不出来 每次都有杂带 想哭....-1


@biostar2009 @飞约疯人院 @youlinglyw 发自小木虫IOS客户端
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zsygxh

金虫 (小有名气)

引用回帖:
12楼: Originally posted by 亲爱的不饿 at 2018-02-08 17:47:36
我想再请教你两个问题 就是如果这条带是降解带怎么处理呢 还有怎么才能鉴别出这是降解带呢? 实验室人做纯化很顺利 我一做就各种出现问题
...

个人认为这是降解带的可能比较低,蛋白降解多数情况都是蛋白酶作用降解导致,首先你的蛋白表达时错误折叠形成包涵体,蛋白聚集在一起很难被降解,即使能降解也只有占比很少的一小部分,洗完包涵体之后直接变性,溶液中的蛋白酶自然也跟着一起变性。所以通常我们纯化可溶蛋白时为防止降解会加各种蛋白酶抑制剂,而做包涵体时,通常我们都不加蛋白酶抑制剂的。至于鉴别,个人认为不好鉴别,不清楚,除非拿去测序,但纯粹浪费钱。你当它是杂带处理吧,几种纯化方式里除了亲和外,离子柱纯化对你的蛋白是比较适合的。
13楼2018-02-08 22:47:36
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亲爱的不饿

新虫 (初入文坛)

2楼2018-02-05 15:45:14
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亲爱的不饿

新虫 (初入文坛)

表达量也可以 但是一纯化就少

发自小木虫IOS客户端
3楼2018-02-05 15:45:23
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苏氨酸

新虫 (小有名气)

包涵体溶解之前,有没有洗杂?建议用低浓度的尿素2M或4M洗杂

发自小木虫Android客户端
4楼2018-02-05 15:54:39
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