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kuaile2008

[交流] 原核表达中,为何诱导不出来?

最近构建好的转化子,跑电泳条带位置正确,测序目的基因也百分百符合。
不知道为何就是诱导不出来?IPTG,温度,诱导时间都试过,跑蛋白电泳还是没条带,急啊,不知原因何在?请表达高手指教!
另:我用的载体是PET32a,用大肠杆菌BL21原核表达,目的基因100多bp。

[ Last edited by 350784478 on 2009-10-11 at 16:15 ]
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kuaile2008

谢谢各位的热心帮助,我诱导失败的原因找到了,是SDS上样缓冲液的问题,可能是原来的BUFFER保存时间太长了不好用,原来是5X的,我新配置2 X的,蛋白电泳就跑的很不错了,下面是我的上样缓冲液的配方:
2X SDS加样缓冲液:
    100mmo1/L   Tris HCl (pH6.8)
    200mmol/L    二硫苏糖醇(DTT)
    2.0%         SDS
    0.03%        溴酚蓝
  20%         甘油
谢谢各位!
4楼2009-03-11 10:07:57
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轻5飞扬

金虫 (正式写手)

不出来的原因很多,可以试试换换菌株,BL21是最早用的,可以试试DE3和rosta(忘记是不是这样写了)
2楼2009-03-05 12:50:15
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nnxqwei

至尊木虫 (职业作家)

PET32a 是T7启动子,要用BL21(DE3)和Rosetta(DE3)才行,宿主没有DE3是不行的哦!
要是用BL21(DE3)和Rosetta(DE3)表达还不出来的话,你用一个确定能表达过其它基因的PET32a ,因为表达载体几经传手后,可能会出错的,我就经常发现同一批重组子里,测序都正确,但有的表达很好,有的没有表达,就是表达载体出错了。。。
3楼2009-03-08 02:00:28
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