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[交流] 原核表达中，为何诱导不出来？

最近构建好的转化子，跑电泳条带位置正确，测序目的基因也百分百符合。
不知道为何就是诱导不出来？IPTG，温度，诱导时间都试过，跑蛋白电泳还是没条带，急啊，不知原因何在？请表达高手指教！
另：我用的载体是PET32a,用大肠杆菌BL21原核表达，目的基因100多bp。

[ Last edited by 350784478 on 2009-10-11 at 16:15 ]

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1楼 2009-03-05 10:25:25

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轻5飞扬

金虫 (正式写手)

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不出来的原因很多,可以试试换换菌株,BL21是最早用的,可以试试DE3和rosta(忘记是不是这样写了)

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2楼2009-03-05 12:50:15

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nnxqwei

至尊木虫 (职业作家)

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专业: 微生物学

PET32a 是T7启动子，要用BL21（DE3）和Rosetta（DE3）才行，宿主没有DE3是不行的哦！
要是用BL21（DE3）和Rosetta（DE3）表达还不出来的话，你用一个确定能表达过其它基因的PET32a ，因为表达载体几经传手后，可能会出错的，我就经常发现同一批重组子里，测序都正确，但有的表达很好，有的没有表达，就是表达载体出错了。。。

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3楼2009-03-08 02:00:28

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谢谢各位的热心帮助，我诱导失败的原因找到了，是SDS上样缓冲液的问题，可能是原来的BUFFER保存时间太长了不好用，原来是5X的，我新配置2 X的，蛋白电泳就跑的很不错了，下面是我的上样缓冲液的配方：
2X SDS加样缓冲液:
100mmo1/L Tris HCl (pH6.8)
200mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)
2.0%       SDS
0.03%       溴酚蓝
  20%       甘油
谢谢各位！

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4楼2009-03-11 10:07:57

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