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15700352310

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因片段连接pET28

求助
我用T4连接酶连接1.7kb的片段（30ng/μL）和pET28a（27ng/μL），亚克隆片段取1μg双酶切（EcoR1和Xho1,EcoR1和Sal1，换了两对引物）3-4小时后胶回收，载体双酶切过夜后胶回收，连接16度过夜，然后做转化，长出来的单菌落不超过10个，但是跑菌落PCR后目的条带很浅，挑菌在5mL LB中摇过夜，但是我提出来的质粒浓度很高，几乎两百以上，pET28是低拷贝，正常我师姐提出来就100左右，跑胶后能看到明显的杂质，然后双酶切或单酶切后都没有目的条带，只看到五千附近的一条带，可能是载体。然后我又用同源重组的方法，重新设计引物，但是长出来的单菌落就三四个，还是挑不出阳性菌落，重复了好几次，还是做不出来，求助求助求助

@gyesang 发自小木虫Android客户端
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1楼 2018-01-09 21:35:29
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15700352310

新虫 (初入文坛)
我还在连接前55度热激片段10分钟，还是挺不出阳性菌落

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2楼2018-01-09 21:36:52
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黑巧克力糖

新虫 (初入文坛)
你有做对照吗？pet28用双酶切后是否切开了？看一下用酶切后pet28的自连情况，如果自连和你连接基因的转化后长出的菌落差不多，说明全是自连。做pet28酶切的时候加去磷酸化。
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不能让知识限制了思想
3楼2018-03-15 16:54:33
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