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长大的小鱼93新虫 (小有名气)
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[求助]
简并引物的设计以及PCR疑问，求助已有2人参与
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定性实验确定所筛菌株含有我要的目的酶，但NCBI上该菌所注释的全部基因没有这个酶的基因，我想通过对比同属的含有该酶的基因设计简并引物来克隆该基因，现在有几个问题想请教。 1、我筛的菌是原核菌株，可以直接根据保守序列来设计兼并引物，以我所筛的菌的全基因组为模版直接PCR就可以了吗？有没有什么需要注意的。我的菌是原核细菌，所以不用提取RNA，再进行反转录吧？ 2、我使用CODEHOP软件设计了两次引物，自己手动选择保守序列区域设计了一次引物，温度梯度PCR都试过了，但均没有结果，请问大家有没有什么设计兼并引物的建议？PCR时简并引物加的量需要增加吗？新手刚开始做实验，希望有经验的前辈可以指导一下，谢谢大家。@biostar2009@飞约疯人院@wizardfan@youlinglyw |
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【答案】应助回帖
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1、进行PCR的时候，不需要进行RT，直接菌落PCR或者提取全基因组进行PCR就可以 2、简并引物病不是说一条引物可以匹配多种突变点。举个例子，如果模板某个位置是A/C的突变，公司合成的简并引物其实是两条，一条在突变位置是A，一条在突变位置是C。换句话说，简并引物是含有突变情况的多引物的混合。所以如果你设计位置上突变较多，你的简并引物就是多条含有不同突变的引物混合，能够和模板进行完全匹配的会少，出现扩增效率低的问题，可能导致没有扩增产物。可以考虑增加引物量提高扩增效率 3、如果这个酶是你转到菌里面进行表达的，建议你根据酶的氨基酸序列，反推出这个基因的序列，然后依据你反推的序列设计引物进行pcr验证。或者使用载体质粒的通用引物进行pcr。 4、检查一下你的pcr试剂是不是正常。进行pcr平行验证，保证你配置的试剂是正常的。 5、加一点荧光染料进你的pcr试剂做荧光pcr，有的时候如果产物很少，电泳可能看不出来，但荧光pcr能够看到很少的产物的，能够看到扩增曲线，然后做个溶解曲线，可以确定产物不是引物二聚体 |
长大的小鱼933楼2018-01-03 09:24:08
长大的小鱼93
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2楼2018-01-02 12:31:16
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4楼2018-01-03 20:58:28
【答案】应助回帖
CODEHOP软件是在线的么？能否提供网页链接，我在这https://virology.uvic.ca/virology-ca-tools/j-codehop/，可是需要JAVA环境，命名下载了Java为什么还是用不了，请指教啊 |
5楼2018-03-06 14:35:47