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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 前辈们，这个情况遇到过么？
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就是柚子啊！

新虫 (正式写手)

[求助] 前辈们，这个情况遇到过么？ 已有2人参与

从提质粒，反转录，pcr，连T，转化，涂板，挑菌，菌落pcr，摇菌，提质粒，每个过程都有条带，也都在目的条带区域。提质粒测序回来，却没有目的条带，非常非常不解，而且做了两次，都没有目的物，两个多月，一点成就都没有！跪求大神帮分析

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1楼 2017-12-15 08:51:50
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arthrospira

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
质粒测序前做了简单的验证吗？比如酶切，是否有目标条带？
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2楼2017-12-15 09:26:27
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就是柚子啊！

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by arthrospira at 2017-12-15 09:26:27
质粒测序前做了简单的验证吗？比如酶切，是否有目标条带？

我们是这样，先去质粒测序，回来看看有没有目的序列，有的话就酶切，没有的话就重做。我就是第一次测序结果没有目的序列，然后又做这次，又没有。所以真心不知道哪有问题

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3楼2017-12-15 09:52:45
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长岛冰茶yo

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能是目的条带根本就不在质粒上呢
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4楼2017-12-15 10:01:14
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就是柚子啊！

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 长岛冰茶yo at 2017-12-15 10:01:14
可能是目的条带根本就不在质粒上呢

对√测序结果就是这样的。难道是连T没连上？转化后都是有菌落，菌落pcr也是有条带的啊！！！

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5楼2017-12-15 10:27:09
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含笑少年。

新虫 (初入文坛)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-12-16 09:57:18
先酶切，确定连进去了再测序。另外，如果你的片段比较长，建议连接的时候用pcr仪控温，16度过夜连接。

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6楼2017-12-15 10:51:23
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cosmos796

禁虫 (职业作家)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-12-16 09:59:18
本帖内容被屏蔽
7楼2017-12-15 12:29:29
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arthrospira

金虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-12-16 09:59:36
引用回帖:
3楼: Originally posted by 就是柚子啊！ at 2017-12-15 09:52:45
我们是这样，先去质粒测序，回来看看有没有目的序列，有的话就酶切，没有的话就重做。我就是第一次测序结果没有目的序列，然后又做这次，又没有。所以真心不知道哪有问题
...

感觉这么做程序不对，测序可能当天不能知道结果，等待的时间长，还要花钱测序；直接酶切，跑个胶就能看结果。
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8楼2017-12-15 13:25:58
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arthrospira

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

实际上每一步实验结果都要验证，确认成功才做下一步。像楼主这样做实验程序是不对的。
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9楼2017-12-15 13:29:51
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就是柚子啊！

新虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by arthrospira at 2017-12-15 13:29:51
实际上每一步实验结果都要验证，确认成功才做下一步。像楼主这样做实验程序是不对的。

我不知道你说的验证是指什么！每一步我都跑胶检测了！结果也都在意料之内！

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10楼2017-12-15 13:40:50
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