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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 大家帮忙想想酶切连接的办法！
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xiaoxiaoye958

银虫 (小有名气)

[交流] 大家帮忙想想酶切连接的办法！

我现在想连一个3000的片段到7000的载体上，但是载体可用的酶切位点只有EcoRI。将载体单酶切后去磷酸化，再与酶切的片段连接。载体：片段（1：5）。但做了几轮都为自连。大家想想有什么更好的办法吗？
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1楼 2009-02-27 15:00:31
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)
★
sxdxrhyy(金币+1,VIP+0):谢谢参与，欢迎常来！ 3-1 10:02
载体去磷酸化不彻底
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漫洒英雄泪，相离处士家。谢慈悲剃度在莲台下。没缘法转眼分离乍。赤条条来去无牵挂。那里讨烟蓑雨笠卷单行？一任俺芒鞋破钵随缘化！
2楼2009-02-27 18:02:51
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chemifunan

木虫 (正式写手)

海王小木虫
★ ★ ★
sxdxrhyy(金币+3,VIP+0):谢谢参与，欢迎常来！ 3-1 10:03
去磷酸化一步做的不彻底 去磷酸的步骤是切好的载体切胶回收 加入碱性磷酸酶 SAP或CIAP都行 水浴15min 然后补加一次酶再水浴15min 注意一定要失活掉去磷的酶 SAP70度加热就可以了 然后加盐 异丙醇沉淀-80度 70乙醇洗洗 抽干OK CIAP最好酚仿抽 然后加盐沉淀 然后后面操作一样 载体少加点 1：5也可以了
你是什么载体 蓝白斑能用吗？ Xgal用LB稀释一下 增大体积减小误差容易涂匀 涂在AgarLB上 这样增加一些效率
我没有去过磷的也做过 运气好 挑到过了 一般去磷是可以连上的
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3楼2009-02-27 19:47:10
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xiaoxiaoye958

银虫 (小有名气)
我用的载体不能蓝白筛选。我做去磷酸化的时候，用酚氯仿抽提再用无水乙醇沉淀，得到的核酸量非常非常少，几乎看不见，所以是改用纯化PCR的柱子纯化的。是不是这一步的影响非常大啊？
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4楼2009-02-28 11:07:00
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chemifunan

木虫 (正式写手)

海王小木虫
沉淀DNA当然看不见 再多也看不见 除非能达到公司合成引物那个量能在管壁看到一些 PCR柱子是回收一般片段用的 过上限会效率降低 你的载体有7K 你的柱子是否高效率的支持大片段就像回收2-3K的东西一样？ 再跑一次胶肯定会影响产率 连接体系一般很乱 载体不用这么弄 酚仿抽了少加水 每次用取个0.5-1ul就行
不能用蓝白就只能多挑几个
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5楼2009-02-28 19:10:54
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xiaoxiaoye958

银虫 (小有名气)
那你能详细的给我讲讲抽提的过程吗？用乙醇沉淀离心后，倒去上清，离心管底部剩余的一点液体里就是所要的去磷酸化产物吗？还需要做其它处理吗？
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6楼2009-02-28 22:54:51
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chemifunan

木虫 (正式写手)

海王小木虫
加5MNaCl 5%体积 然后用1V异丙醇或3V乙醇沉淀 12000rpm 然后去上清 再用75%洗 12000rpm 离心去上清 晾干 加少量水（不要用TE 会影响连接） 然后当作载体 20uL体系加0.5-1uL
沉淀在-80度比较好 你的75%的乙醇最后洗之前放到4度冰箱预冷一下 离心推荐在冷冻离心机离
沉淀一定要加盐 要不沉不下来 冷冻增加效率
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7楼2009-03-01 17:37:22
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xiaoxiaoye958

银虫 (小有名气)
谢谢你 我试试
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8楼2009-03-02 12:37:58
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36678293

铜虫 (正式写手)
需要帮助吗，可以联系QQ:36678293,最低的价格，低的让你满意为止，200元一个克隆，不要测序！
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9楼2009-03-04 00:30:52
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