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xiaoxiaoye958

银虫 (小有名气)

[交流] 大家帮忙想想酶切连接的办法!

我现在想连一个3000的片段到7000的载体上,但是载体可用的酶切位点只有EcoRI。将载体单酶切后去磷酸化,再与酶切的片段连接。载体:片段(1:5)。但做了几轮都为自连。大家想想有什么更好的办法吗?
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chemifunan

木虫 (正式写手)

海王小木虫

沉淀DNA当然看不见 再多也看不见 除非能达到公司合成引物那个量能在管壁看到一些 PCR柱子是回收一般片段用的 过上限会效率降低 你的载体有7K 你的柱子是否高效率的支持大片段就像回收2-3K的东西一样? 再跑一次胶肯定会影响产率 连接体系一般很乱 载体不用这么弄 酚仿抽了少加水 每次用取个0.5-1ul就行
不能用蓝白就只能多挑几个
Bemühen Sie !
5楼2009-02-28 19:10:54
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)


sxdxrhyy(金币+1,VIP+0):谢谢参与,欢迎常来! 3-1 10:02
载体去磷酸化不彻底
漫洒英雄泪,相离处士家。谢慈悲剃度在莲台下。没缘法转眼分离乍。赤条条来去无牵挂。那里讨烟蓑雨笠卷单行?一任俺芒鞋破钵随缘化!
2楼2009-02-27 18:02:51
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chemifunan

木虫 (正式写手)

海王小木虫

★ ★ ★
sxdxrhyy(金币+3,VIP+0):谢谢参与,欢迎常来! 3-1 10:03
去磷酸化一步做的不彻底 去磷酸的步骤是切好的载体切胶回收 加入碱性磷酸酶 SAP或CIAP都行 水浴15min 然后补加一次酶再水浴15min 注意一定要失活掉去磷的酶 SAP70度加热就可以了 然后加盐 异丙醇沉淀-80度 70乙醇洗洗 抽干OK CIAP最好酚仿抽 然后加盐沉淀 然后后面操作一样 载体少加点 1:5也可以了
你是什么载体 蓝白斑能用吗? Xgal用LB稀释一下 增大体积减小误差容易涂匀 涂在AgarLB上 这样增加一些效率
我没有去过磷的也做过 运气好 挑到过了 一般去磷是可以连上的
Bemühen Sie !
3楼2009-02-27 19:47:10
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xiaoxiaoye958

银虫 (小有名气)

我用的载体不能蓝白筛选。我做去磷酸化的时候,用酚氯仿抽提再用无水乙醇沉淀,得到的核酸量非常非常少,几乎看不见,所以是改用纯化PCR的柱子纯化的。是不是这一步的影响非常大啊?
4楼2009-02-28 11:07:00
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