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大家帮忙想想酶切连接的办法！
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| 我现在想连一个3000的片段到7000的载体上，但是载体可用的酶切位点只有EcoRI。将载体单酶切后去磷酸化，再与酶切的片段连接。载体：片段（1：5）。但做了几轮都为自连。大家想想有什么更好的办法吗？ |
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6楼2009-02-28 22:54:51
2楼2009-02-27 18:02:51
chemifunan
木虫 (正式写手)
海王小木虫
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sxdxrhyy(金币+3,VIP+0):谢谢参与，欢迎常来！ 3-1 10:03
sxdxrhyy(金币+3,VIP+0):谢谢参与，欢迎常来！ 3-1 10:03
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去磷酸化一步做的不彻底 去磷酸的步骤是切好的载体切胶回收 加入碱性磷酸酶 SAP或CIAP都行 水浴15min 然后补加一次酶再水浴15min 注意一定要失活掉去磷的酶 SAP70度加热就可以了 然后加盐 异丙醇沉淀-80度 70乙醇洗洗 抽干OK CIAP最好酚仿抽 然后加盐沉淀 然后后面操作一样 载体少加点 1：5也可以了 你是什么载体 蓝白斑能用吗？ Xgal用LB稀释一下 增大体积减小误差容易涂匀 涂在AgarLB上 这样增加一些效率 我没有去过磷的也做过 运气好 挑到过了 一般去磷是可以连上的 |
3楼2009-02-27 19:47:10
4楼2009-02-28 11:07:00