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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 医学 » 请教：细胞免疫荧光
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xuemei1984

禁虫 (小有名气)
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1楼 2009-02-24 19:27:31
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verbal2005

金虫 (职业作家)
★
xuemei1984(金币+1,VIP+0):谢谢啦！ 2-25 12:52
吸净培养液，用PBS冲洗5分钟×2次 ， 之 后 加100%冰甲醇固定(每孔1000ul)，-20℃冰箱放置20分钟。采用免疫法进行细胞免疫荧光染色。操作步骤简述如下：
1．细胞以100%甲醇-20℃固定10-20分钟，用PBS冲洗2-3次，TPS/Triton100洗3次，5min/次；PBS洗5min;
2．正常山羊血清封闭液，室温封闭45-60min，PBS洗去多余液体；
3．分别滴加一抗37℃孵育2小时；
4．TPS/Triton100洗5min×3次，滴加罗丹明标记的二抗IgG，37℃1小时（闭光），PBS洗，5min×3次；
5.DAPI染核10分钟
6.PBS洗3次
7．滴加抗荧光淬灭剂封片；
8．镜检。
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2楼2009-02-25 09:26:04
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xuemei1984

禁虫 (小有名气)
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3楼2009-02-25 12:51:50
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verbal2005

金虫 (职业作家)
只要不涉及透膜的冲洗都可以用PBS或者TBS冲洗
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4楼2009-02-25 21:23:51
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nursingdandan

金虫 (初入文坛)
★
xuemei1984(金币+1,VIP+0):谢谢参与！ 3-13 18:03
将神经干细胞球吸出并转移至涂有多聚赖氨酸的24孔板中，370C, 5%C02培养箱中培养2小时使细胞贴壁，吸除细胞培养液，每孔加入神经干细胞分化液0.5m1, 37℃，5%CO2培养箱中培养7天，吸除细胞分化液，0.01MPBS洗片，加4%多聚甲醛固定细胞30分钟，0.01MPBS洗片3次，加入0.1 % Triton 破膜10分钟，0.01MPBS洗片3次，加入2%BSA室温下封闭30分钟，分别加入一抗羊抗Tuj-1抗体和兔抗Vimentin抗体，于4℃过夜，0.01MPBS洗片3次，分别加荧光二抗羊抗兔IgG-Cy3，室温下避光2小时，荧光显微镜下观察。
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5楼2009-03-12 12:37:25
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nursingdandan

金虫 (初入文坛)

细胞免疫荧光 附加

不同指标替换一下即可以，只是抗体浓度要多试几遍。
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6楼2009-03-12 12:39:47
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yang0071

木虫 (职业作家)
★ ★ ★
xuemei1984(金币+1,VIP+0):谢谢！ 5-7 13:59
xuemei1984(金币+2,VIP+0):谢谢 5-21 18:12
免疫荧光
1） 处理盖玻片
将盖玻片用2 M NaOH 浸泡2h，洗净后置于70％乙醇中备用；
2） 细胞培养
从70％乙醇中取出盖玻片，晾干；将盖玻片放入6 孔板中，分适量细胞于其上，使单层细胞铺至60％培养面积；
3） 固定
弃去培养液，用PBS 洗涤盖玻片，加入2 ml 4％多聚甲醛室温静置约30 min；PBS 洗涤，10 min×3 次，缓摇（若细胞贴壁能力差，则静置洗涤，下同）；
4） 透化
吸干PBS，加入含0.2％Triton X-100、1%BSA 的PBS 约1 ml；冰上静置5 min；PBS 洗涤，10 min×3 次；
5） 封闭
吸干PBS，于六孔板相应孔中加入1 ml 含1％BSA 的PBS，室温封闭1 h；PBS 洗涤，10 min×3 次；
6） 一抗结合
一抗按适当滴度稀释在含1％BSA 的PBS 中，滴在PARAFILM 膜上；从培养孔中取出盖玻片，用吸水纸擦去背面及细胞面边缘处，细胞面朝下轻轻放在PARAFILM 膜上，与抗体均匀接触；室温，避光，静置2～3 h；
7） 二抗结合
取下盖玻片，放入细胞培养板相应孔中，PBS 洗涤，10 min×3 次；在含1％BSA 的PBS 中稀释荧光二抗至4mg/ml（约1:100），滴在PARAFILM膜上；从培养孔中取出盖玻片，用吸水纸擦去背面及细胞面边缘处，细胞面朝下轻轻放在PARAFILM 膜上，与抗体均匀接触；室温，避光，静置1～1.5 h；
8） 荧光检测
取下盖玻片，放入细胞培养板相应孔中，PBS 洗涤，10 min×3 次；取载玻片，滴少量10％甘油（约50 ul），将盖玻片细胞面朝下放在载玻片上；荧光显微镜或激光共聚焦显微镜检测相应荧光（40～100×油镜）。
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7楼2009-05-06 13:15:42
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xutao

金虫 (著名写手)

第三军团总参谋
不知道楼是做免疫组化还是要做流式分析
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第三军团
8楼2009-05-08 00:23:28
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xuemei1984

禁虫 (小有名气)
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9楼2009-05-19 12:49:23
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