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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » PEG介导转化丝状真菌，基因敲除后，用什么质粒回补？
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superharry

至尊木虫 (职业作家)

[求助] PEG介导转化丝状真菌，基因敲除后，用什么质粒回补？

大家好！请教一个问题。
丝状真菌被敲除基因后，想把基因回补，验证基因功能，想用PEG介导转化原生质体，构建载体的策略是：筛选标记cassette + 目的基因 cassette（目的基因自身启动子+目的基因原始DNA+自己自身的终止子），把上面的两个cassette 分布克隆到一个载体（回补载体基础框架，此载体不知道该采用什么载体？pMD18T可以吗----最终载体可能达到10000bp？双元载体可以吗----终载体可能达到14000bp？丝状真菌表达载体？如pAN7-1，请问改用什么载体框架可行？），得到回补载体，回补载体通过PEG介导转入敲除株的原生质体，请问这种策略是否可行？
另外还有一个策略，就是把上面的两个表达框克隆到双元载体里，通过农杆菌介导转化，转入敲除株的分生孢子。
请教大家如何做比较好! 非常感谢！
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1楼 2017-11-20 21:22:18
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前行的璐

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by superharry at 2017-11-21 15:26:28
我的目的不是用来表达的，是让质粒上的片段整合到基因组。当然，如果能表达最好，但是我还没做，正在设计实验，所以特来求助。...

好吧，我也来学习学习
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5楼2017-11-21 22:27:34
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普通回帖

superharry

至尊木虫 (职业作家)
看到农科院的几篇学位论文  用了pbluescript ii ks质粒 加入筛选标记和目的基因，然后直接转真菌的原生质体，用于回补。看了pbluescript ii ks质粒，他只是原核克隆载体。
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2楼2017-11-20 22:31:13
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前行的璐

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by superharry at 2017-11-20 22:31:13
看到农科院的几篇学位论文  用了pbluescript ii ks质粒 加入筛选标记和目的基因，然后直接转真菌的原生质体，用于回补。看了pbluescript ii ks质粒，他只是原核克隆载体。

那原核克隆载体转入真菌的原生质体，能表达吗？有结果吗？
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3楼2017-11-21 10:50:56
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superharry

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 前行的璐 at 2017-11-21 10:50:56
那原核克隆载体转入真菌的原生质体，能表达吗？有结果吗？...

我的目的不是用来表达的，是让质粒上的片段整合到基因组。当然，如果能表达最好，但是我还没做，正在设计实验，所以特来求助。
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4楼2017-11-21 15:26:28
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superharry

至尊木虫 (职业作家)
没人吗？求助！
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6楼2017-11-25 15:19:08
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gy111

新虫 (小有名气)
你好，请问你是用的同源臂进行基因敲除的吗？
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7楼2018-01-22 11:37:09
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superharry

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by gy111 at 2018-01-22 11:37:09
你好，请问你是用的同源臂进行基因敲除的吗？

已发私信
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8楼2018-01-22 14:58:40
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BOMN

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by superharry at 2018-01-22 14:58:40
已发私信...

亲，能给我也发一个

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9楼2018-04-12 01:08:51
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superharry

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by gy111 at 2018-01-22 11:37:09
你好，请问你是用的同源臂进行基因敲除的吗？

对
10楼2018-04-12 09:14:00
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