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superharry

至尊木虫 (职业作家)

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[求助] PEG介导转化丝状真菌，基因敲除后，用什么质粒回补？

大家好！请教一个问题。
丝状真菌被敲除基因后，想把基因回补，验证基因功能，想用PEG介导转化原生质体，构建载体的策略是：筛选标记cassette + 目的基因 cassette（目的基因自身启动子+目的基因原始DNA+自己自身的终止子），把上面的两个cassette 分布克隆到一个载体（回补载体基础框架，此载体不知道该采用什么载体？pMD18T可以吗----最终载体可能达到10000bp？双元载体可以吗----终载体可能达到14000bp？丝状真菌表达载体？如pAN7-1，请问改用什么载体框架可行？），得到回补载体，回补载体通过PEG介导转入敲除株的原生质体，请问这种策略是否可行？
另外还有一个策略，就是把上面的两个表达框克隆到双元载体里，通过农杆菌介导转化，转入敲除株的分生孢子。
请教大家如何做比较好! 非常感谢！

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1楼 2017-11-20 21:22:18

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前行的璐

新虫 (小有名气)

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4楼: Originally posted by superharry at 2017-11-21 15:26:28
我的目的不是用来表达的，是让质粒上的片段整合到基因组。当然，如果能表达最好，但是我还没做，正在设计实验，所以特来求助。...

好吧，我也来学习学习

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5楼2017-11-21 22:27:34

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superharry

至尊木虫 (职业作家)

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看到农科院的几篇学位论文用了pbluescript ii ks质粒加入筛选标记和目的基因，然后直接转真菌的原生质体，用于回补。看了pbluescript ii ks质粒，他只是原核克隆载体。

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2楼2017-11-20 22:31:13

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前行的璐

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引用回帖:

2楼: Originally posted by superharry at 2017-11-20 22:31:13
看到农科院的几篇学位论文用了pbluescript ii ks质粒加入筛选标记和目的基因，然后直接转真菌的原生质体，用于回补。看了pbluescript ii ks质粒，他只是原核克隆载体。

那原核克隆载体转入真菌的原生质体，能表达吗？有结果吗？

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3楼2017-11-21 10:50:56

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