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psiCHECK2构建载体遇到问题
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双酶切： 用的Not1和Xho1酶。载体双酶切的时候，载体长度6000+bp，双酶切，结果跑胶，有一条带（两个酶切位点之间只有30+bp,切下去了跑胶会看到吗？）。但是全部胶回收的时候有时候会有两条带，都很亮，500+bp和大于2000bp的，是质粒的不同形态吗？是不是说明我没切开？如果切开应该是什么情况？是不是要全部是线型的，然后长度就是6000+bp才对? 有几次感觉目的片段双酶切后胶回收大小也不对，本来315bp，胶回收的时候感觉在500bp左右，也不知道是怎么回事。高保真酶PCR产物和连在T载体上的都来酶切过。 连接： 我还是切了最长的那端胶回收，但是胶回收浓度都很低，10ng/ul左右，PCR产物胶回收后更低。看有的帖子说胶回收后浓度就是很低，测不出来，要看条带亮度来决定最后的体积比，但是又有人说连接比例是要看摩尔比，所以我搞不懂了。而且胶回收浓度那么低，跑胶跑的出来吗？ 做了好久了，一直弄不好，还是想问每一步的结果都要怎么检测？怎样才是正确的？不然这样迷迷糊糊做到转化涂板，菌液PCR也是没结果。 求助 |
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